RNA测序-方法学说明

概述

GCBI使用目前最新最高效的转录组分析流程（HISAT2+STRINGTIE+BALLGOWN），使用HISAT2方法将测序原始的fastq文件比对到Ensembl数据库中，根据STRINGTIE方法对序列进行组装和定量，得到转录本和基因在样本中的相对表达值，最后根据BALLGOWN算法或倍数法进行差异分析。与经典的Tophat, Cufflink的RNA-seq分析流程相比，新的分析流程在性能，效率，分析结果的准确性上都有很大的提升，在较短的时间内即可获得更准确的分析结果。

分析步骤

比对（HISAT2）

利用 HISAT2软件将reads比对到UCSC的hg38版本的人类标准基因组，结合Ensembl转录本数据库中的剪切位点，使用比对算法实现每条原始reads的最优比对。此外HISAT2的参考基因组的索引构建中综合利用了dbSNP数据库中的约12.3M的常见SNP位点以及使得整个比对率更高、比对效果更好。

排序

利用samtools将比对结果进行排序得到bam文件。

组装和定量

使用StringTie软件对每一条rna，用比对结果的reads碎片组装成真实长度的rna序列。在这个过程中，也考虑到各个剪切位点，参考数据库为Ensembl的GRCh38.84版本的转录本gtf文件。经过上述步骤，我们可以得到每个样本转录本的定量结果

质控

在上述步骤中同步进行质量分析，对样本进行质控结果的统计。

以Q30>80%作为质控合格的标准，对样本进行质控合格或不合格的判断。

差异分析

利用Ballgown软件进行差异分析。差异分析会依据不同样本的reads深度进行参数校正，从而得到基因层面与转录本层面更为合理的结果。

分析流程图

参考文献

[1] Kim D, Langmead B and Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods 2015

[2] Pertea M, Kim D, Pertea G, Leek JT and Salzberg SL. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols 2016

[3] Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT  & Salzberg SL. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads Nature Biotechnology 2015, doi:10.1038/nbt.3122

[4] Pertea M, Kim D, Pertea GM, Leek JT, Salzberg SL Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown, Nature Protocols 11, 1650-1667 (2016), doi:10.1038/nprot.2016.095

[5] Frazee AC, Pertea G, Jaffe AE, Langmead B, Salzberg SL, Leek JT Ballgown bridges the gap between transcriptome assembly and expression analysis. Nat Biotechnol. 2015 Mar;243-6. pii:nbt.3172. doi:10.1038/nbt.3172.

备注

RNA测序Demo样本信息