外泌体系列3：研究思路与检测方法

在前两次外泌体课程中介绍了外泌体的定义，作用，历史及从实验的角度讲解了不同样本收集时的注意事项。作为本系列的终结篇，这次以cell的一篇文章为例，介绍了外泌体研究中的基本思路。

案例：

Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways

实验对象：基质细胞MRC5与乳腺癌细胞

相关基因：RIGI（乳腺癌）、RAB27B（MRC5） PMID: 25417103      影响因子 28.710    GEO相关样本： 51

实验背景

研究发现，当基质细胞MRC5和各种乳腺癌细胞共培养时，某些乳腺癌细胞会产生耐药性。Why?How?是否会是外泌体的作用呢？

实验思路

• 是否真的是外泌体在发挥作用？

在外泌体的研究中，这是首要问题。怎么做？直接将外泌体和乳腺癌细胞共培养，看乳腺癌是否同样能产生抗药性。是溶液中其他物质的影响，作者做了对比实验，收集了共培养溶液中的外泌体，将外泌体及剩下的溶液分别加入乳腺癌细胞中，发现只有加入外泌体的乳腺癌细胞出现了类似耐药性的性状。

• 究竟是谁分泌了外泌体呢？

这是外泌体体研究中一个方向性的问题，到底是谁在影响谁？作者做了两个实验来进行验证。第一个是染色实验，作者用两种亲脂性的染料分别将基质细胞和乳腺癌细胞染色，共培养后发现只有乳腺癌细胞的膜表面颜色发生了变化，由此可判断是基质细胞的部分膜转移到了乳腺癌细胞。

作者并从分子层面进行了验证，将共培养中的外泌体及两种细胞单独培养的外泌体做了蛋白芯片，发现共培养中外泌体中的蛋白成分和基质细胞单独培养分泌的外泌体蛋白更相似。两个实验都证明了外泌体是由基质细胞分泌的。在实验的大前提下，我们可以接下去探究分子层面的机制问题。

3、外泌体对乳腺癌细胞的影响

作者将共培养的乳腺癌细胞做了转录组分析，发现与治疗相关的基因群如IRDS,ISG，PRRS,HOTCH3发生了差异表达，其中IRDS和ISG与干扰素相关，PRRS是模式识别中的受体，这三个基因群参与了细胞抗病毒过程，并和肿瘤的耐药性相关。到底是哪些基因在发挥作用呢？作者在潜在基因目标中进行了干扰试验，最后找到了信息受体RIG-I蛋白和关键基因STAT2。

• 外泌体中的哪些物质在发挥作用？

外泌体中含有多种RNA及蛋白质，那到底是什么物质在起作用呢？因RIGI蛋白能与5’端三磷酸RNA结合，所以作者假设是外泌体中的RNA在起作用。作者用人工囊泡将exoRNA，阳性RNA（5’端三磷酸RNA），阴性RNA包裹，分别于乳腺癌细胞共培养，发现exoRNA，阳性RNA能激活乳腺癌IRDS基因群的高表达，间接说明乳腺癌细胞产生了耐药性。

5、影响外泌体分泌的关键基因有哪些？

在共培养过程中，外泌体含量明显升高，那是什么促进了外泌体的分泌呢？对基质细胞进行芯片分析，发现RAB27B明显上调，其已经被证实其参与外泌体的分泌。是不是RAB27B影响基质细胞外泌体的呢?对RAB27B进行干扰实验，发现外泌体含量明显降低。

外泌体研究流程即理清三者之间的关系。

基质细胞和乳腺癌细胞之间的作用通路图如下：

实验tips：

1、共培养

在共培养实验方案设计中，还需注意共培养方式的问题。在不同的培养方式中，可能会产生不同的结果。作者用一个滤膜（允许外泌体通过）隔开两种细胞共同培养，发现乳腺癌细胞耐药性消失。作者推测在乳腺癌耐药性的产生过程中，需要近分泌与外泌体的协同作用，即细胞之间需要直接接触 。

• 染色方法
• 重要基因的评估——回归分析
• 干扰实验
• 基因芯片
• 蛋白芯片
• exoRNA的高通量检测方法

附录：

视频：外泌体系列1.初识外泌体

外泌体系列2.收集与保存

  外泌体系列3.研究思路与检测方法