外泌体系列1：外泌体入门篇

外泌体在1980年首次被发现后，其被认为是细胞排泄废物的一种方式。随着研究不断加深，发现外泌体功能多样，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。近年来外泌体研究热度持续增长，从2011年后发表文章数量激增。

在应用方面，外泌体被广泛应用于液体活检。由ExosomeDiagnostics开发的全球首个基于外泌体RNA的液体活检产品于今年1月份上市，其可灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EML4-ALK突变。

外泌体如此之火，今天就带大家认识下外泌体，从定义、形成、功能和分离详细介绍了关于外泌体的基础知识。

1.那啥是外泌体呢？

Exosome，外泌体，细胞分泌到胞外的小体，就是这么简单，理解起来毫无压力。那细胞会分泌多种囊泡，如何去判断是否是外泌体呢？

只要把握两点即可。

• 从大小上去判断，外泌体的直径在40-100nm之间，而且是大小均一的圆球体。
• 从形成过程上看，其是来源于细胞内吞作用形成的内体，内体在成熟过程中内部会形成圆球状的小体，后与细胞膜融合释放出的小体即是外泌体。

Tips：下图是外泌体形成的示意图，右方粉色的囊泡就不是外泌体，咋看？是大小不均一，二它是以出芽的方式形成。

2.那外泌体长啥样呢？

下面两幅图片是外泌体的模拟图和结构示意图。左图中绿色的小球就是外泌体，我们可以明显看到其膜上的突起和球中的内含物。具体是啥成分呢？通过研究发现，膜上的突起是外泌体的膜蛋白，其在靶向结合过程中有着重要作用。内含物主要是蛋白质和RNA，RNA种类主要是miRNA，其他就是是lnRNA,mRNA，tRNA或是一些RNA片段。

3.关于外泌体大家都在研究些啥呢？

目前关于外泌体的研究大致可以分为三个方向。

Discovery research-探索型

主要研究不同细胞，个体在不同情况下分泌的外泌体种类、数目、大小和内含物的变化及其作用机制。

作为细胞间的摆渡车，外泌体主要介导细胞间通讯和在免疫方面起作用。

如下面这篇文章（PMID: 25417103）就介绍了基质细胞分泌的外泌体可以与乳腺癌细胞膜表面的蛋白结合，其激活了某些蛋白和通路使得乳腺癌细胞获得治疗的耐受性。这篇文章实验设计严密，大家可以借鉴一下。

下面这篇呢(PMID: 25035954)介绍了Treg细胞以外泌体为载体将miRNA运送到Th1等免疫细胞，以此来起到抑制炎症反应的作用。这篇文章非常具有代表性，其实验设计就是外泌体研究的经典思路，想做这方面研究的同学可以参考一下。

外泌体在免疫中的角色多样，2002年发表在nature中的一篇综述就详细介绍了外泌体在免疫中的角色。有兴趣的可自行下载。

EXOSOMES: COMPOSITION, BIOGENESIS AND FUNCTION

Diagnostic research——诊断型

主要研究外泌体种类、数目、大小和内含物与疾病之间的关系，其可预测疾病的发生与进展

Preparative research——制备型

在靶向药物的研究中，外泌体可作为载体可将包裹在其内的药物运送到目标区域。

4.那如何获取外泌体呢？

要研究外泌体，首要问题就是如何获取外泌体。目前分离方法主要有以下几种，超速离心、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁珠抗体捕获、凝胶过滤层析、商用试剂盒等。综合考虑纯度和得率，目前主要采用超速离心和商用试剂盒。

超速离心的思路是先分步差速离心，逐步清除样本中的细胞和杂质，再最后两次长时间超高速离心分离得到外泌体，文献中报道的离心力多是10^4转。基本流程图如下：

从图上我们可以看到最后两步最耗时，看到文献中最长离心时间为16个小时，离心机得很强大呀。在选用超高速分离外泌体需要注意的是，不同细胞分泌的外泌体各不一样，沉降系数也有区别，所以需要根据具体的情况进行条件优化，选择合适的离心力及时间。

SBI 和 ThermoFisher提供分离外泌体的试剂盒。试剂盒的基本流程如下：

思路和超高速离心差不多，首先去除样本中的细胞和杂质，不同的是中间多了一步试剂温育，最后短时间低速离心即可分离得到外泌体。相对于高速离心，用试剂盒步骤简单、时间短且对仪器要求低。那试剂盒如何做到快速且低速即可分离出外泌体呢？奥秘就在于中间添加的孵育试剂PEG——聚乙二醇，PEG的吸水性能让外泌体更易沉淀。在选用试剂盒的时候一定要注意试剂盒是针对什么样本的，因试剂盒对样本很敏感，用于血清分离外泌体的不能用于血浆。

NO FBS

在前期细胞培养过程中，需要特别注意FBS，因其含有大量的外源性外泌体，会影响后续实验。可采取在培养基中不加FBS或者采用过滤掉外源性外泌体的FBS。

5.最后回归一个问题，那哪些细胞会分泌外泌体呢？

Exosomes are secreted by all mammalian cell types in culture.

附录：

视频：外泌体课程1