治疗研究

  骨髓纤维化慢性期的CD34阳性细胞驱动白血病细胞转化的突变克隆已在单细胞水平可检测

英文名:Mutated clones driving leukemic transformation are already detectable at the single-cell level in CD34-positive cells in the chronic phase of primary myelofibrosis
 
期刊:NPJ Precis Oncol. 2021; 5: 4. Published online 2021 Feb 4. doi: 10.1038/s41698-021-00144-9
 
作者单位:
  • Centre for Regenerative Medicine “S. Ferrari”, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy
  • Humanitas Clinical and Research Center - IRCCS, Rozzano – Milan, Italy
  • Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano - Milan, Italy
  • Center for Genome Research, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy
  • Department of Medical and Surgical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy
  • Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, Pieve Emanuele - Milan, Italy
作者:Sandra Parenti, Sebastiano Rontauroli, Chiara Carretta, Selene Mallia, Elena Genovese, Chiara Chiereghin, Clelia Peano, Lara Tavernari, Elisa Bianchi, Sebastian Fantini, Stefano Sartini, Oriana Romano, Silvio Bicciato, Enrico Tagliafico, Matteo Della Porta, and Rossella Manfredini

文章内容主要内容:

骨髓增生性肿瘤(MPN)的疾病进展表现为基因组不稳定性增加,细胞分群及克隆演进。本研究发现了MPN进展为AML的克隆动力机制,还发现了干扰素信号通路通路被抑制是酪氨酸蛋白激酶抑制剂耐药的主要愿意。研究中,使用单细胞基因组和转录组测序检测原发性骨髓纤维化患者的CD34阳性细胞群,这些患者在接受鲁索替尼(酪氨酸蛋白激酶抑制剂)治疗后进展为AML。单细胞基因组分析克隆进化树显示,TET2突变基因是起始突变,而FLT3是终止突变。 疾病随着克隆异质性和突变率的进展而进展,携带TP53和FLT3的突变在慢性期已经出现。原发性骨髓纤维化向AML转化的主要相关因素是T细胞分化抑制、免疫逃逸,以及鲁索替尼治疗后干扰素信号通路失活。

方法:

  1. 患者选择:1例原发性骨髓纤维化,采集三个时间点:慢性期内1个时间点Time 1,鲁索替尼治疗8个月后时间点Time 2,鲁索替尼治疗11个月后且诊断为AML的时间点Time 3;
  2. 髓系肿瘤相关基因靶向捕获测序;
  3. 磁珠分选CD34+细胞,使用液滴细胞分配仪将CD34+细胞分入单孔;
  4. 300个单孔单细胞使用全基因组测序,一代测序、定量PCR、MLPA验证,验证SRSF2、TET2、FLT3、TP53突变及拷贝数变异;
  5. 构建突变克隆进化树;
  6. 单细胞转录组测序探索分析三个时间点细胞群集标志性基因;
  7. 流式鉴定T细胞免疫亚型: 鉴定指标是CD3、CD4、CD8、CD38、HLA-DR

成果:

单细胞突变克隆演化

  • 单细胞基因组突变检测发现,TET2和FLT3突变分别是起始时间点突变和终止时间点突变,随着三个时间点进展,CD34+细胞克隆异质性增加;
  • TP53无拷贝数变化,但有exon2-exon4的短片段缺失(454bp),且p.Cys238Ser出现在Time 2中小群细胞,Time 3的变异频率进一步增加,该突变疾病进展密切相关。

单细胞转录组发现细胞分群特征

  • 单细胞转录组分析,三个时间点细胞共有如下细胞分群:
    • megakaryocyte-erythroid progenitors (MEPs)
    • hematopoietic stem cells (HSCs)
    • multipotent progenitors (MPPs)
    • granulocyte and monocyte progenitors (GMPs)
    • Eosinophil Basophil and Mastocyte (Eo/B/Mast) progenitorsMyeloid biased progenitors.
  • 通过轨迹分析,定位了7种进化状态的细胞;
  • 治疗11月后进入AML阶段的细胞群Time 3包含43.8%的hematopoietic stem cells和multipotent progenitors,而两类细胞在MPN 的Time 1中仅占17.6%;
  • MPN阶段的Time 1主要的细胞类型为myeloid biased progenitors,占37.1%,其次是 megakaryocyte-erythroid progenitors占30.5%。说明在AML状态下的CD34+细胞特性主要以去分化状态为主。

鲁索替尼耐药机制

  • 鲁索替尼治疗后耐药,与肿瘤逃逸免疫监控为主要特点,主要机制是:鲁索替尼抑制干扰素信号通路,从而导致HLA-I和HLA-2下调;
  • PD1/PDL1轴也参与其中,通过影响T细胞凋亡抑制T细胞增殖与激活;
  • 单细胞转录组测序发现,在治疗8个月后的Time 2时间点上,megakaryocyte-erythroid progenitors cells和hematopoietic stem cells的免疫抑制通路PD1/PDL1是激活状态,而在Time 3megakaryocyte-erythroid progenitors cells免疫抑制通路PD1/PDL1是激活状态。流式细胞检测同样证实了这个结论;
  • FLT3高表达是AML的高风险因素,该基因在Time 2的 multipotent progenitors cells 、 hematopoietic stem cells、granulocyte and monocyte progenitors cells中显著高表达,而在Time 3中,主要高表达在megakaryocyte-erythroid progenitors cells上,该结果也被其他数据集所验证。

本文由 GCBI学院 作者:其明技术专家 发表,转载请注明来源!

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