单细胞测序

不敢相信!1次实验测200万个单细胞?!

 
普通人做单细胞测序,3000-5000个细胞;文献中的大佬们做单细胞测序,1万个细胞,10万个细胞,50万个细胞,200万个细胞……只能望paper感叹“他们是如何做到的啊——难道是每次5000个细胞,做n次试验吗?来让我算一下n=?这也太贵了吧!玩不起玩不起……”

等一下,这么多次试验不说钱烧不烧得起,就是这种机械重复的思路也太蠢了吧……

果然,小编查阅文献发现,大佬自有妙计,来看一下这篇发表在nature上的文章是如何实现1次实验200万个细胞的?

  • 标题:The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis
  • 期刊:Nature
  • 影响因子:41.577(2018)
  • 研究领域:胚胎发育研究
  • 样本:小鼠胚胎妊娠期9.5天至13.5天的胚胎细胞

 

研究背景
  1. 大多数哺乳动物器官发生的研究都依赖模式生物,其中小鼠尤其常用。小鼠发育迅速,受精和分娩之间仅需21天。
  2. 在E9.5-E13.5,胚胎从数十万个细胞扩大到超过一千万个细胞,并同时发育几乎所有的主要器官系统。尽管这四天已有深入研究,但实际上,这个窗口可以研究构成主要发育缺陷的大多数基因。
  3. 单细胞转录组功能分析可用于解决全景式发育图谱构建的有效策略,而目前所报道的发育图谱的构建都局限于组织的分辨率,并没有涉及到发育过程中细胞类型的动态变化。 
内容摘要
哺乳动物器官发生是一个了不起的过程。在短时间内,三胚层细胞转变成包含大部分主要内外部器官的胚胎。本文中,作者在单细胞分辨率下研究了小鼠器官发生的转录动力学作者使用单细胞组合标签法在一次实验中分析了来自61个胚胎的大约200万个细胞的转录组,所述61个胚胎在妊娠9.5和13.5天之间分阶段进行。由此产生的“小鼠器官发生细胞图谱”(MOCA)提供了关键窗口期间发育过程的全局视图。作者使用Monocle 3识别了数百种细胞类型和56种轨迹(其中许多仅由于细胞覆盖的深度而被检测到),并且共同定义了数千种相应的标记基因。作者还探索了基因在细胞类型和轨迹中的动态变化,包括对顶端外胚层嵴、肢体间充质和骨骼肌的集中分析。 

研究结果
01
200万个细胞的单细胞测序
作者收集了五个发育时期(E9.5、E10.5、E11.5、E12.5或E13.5)的61个小鼠胚胎,构建了200万个细胞(2,072,011)的单细胞测序文库,产生了110亿个reads.(图1a)。作者分析得到每个胚胎的细胞中位数为35272个(图1b),通过拟时间轨迹分析排序小鼠胚胎的发育过程。(图1c)
▲图1
02
鉴定细胞类型和亚型
作者对2, 058,652个单细胞转录组进行了Louvain聚类和t -SNE分析(图2a)。来自相同发育阶段的复制胚胎细胞出现了类似的分布,而来自不同阶段的则没有。作者鉴定到38个主要的细胞类型和655个细胞类型的亚型(图2b)。其中检测到17,789个基因表达,鉴定了2,863个细胞类型的marker genes,平均一个细胞类型有75个不同的marker genes。

▲图2
03
 顶端外胚层嵴(AER)的特征分析
作者注释了内皮层和外皮层的所有亚型(图3a),专注检测了AER增殖的动态过程和基因表达,展示了Pathway-level分析。 

▲图3
 
04
重建发育轨迹
接下来,作者试图研究细胞类型在哺乳动物器官发生过程中所经历的发育轨迹。为了分析数百万个细胞及克服其他限制,作者开发了新版本的Monocle。Monocle将1,524,792个高质量细胞(UMI大于400)组织成12组。(图4a、b)
▲图4
去除对应于双重注释细胞和/或亚群的12%细胞之后,作者迭代地重新分析了10个主要轨迹(图5)。
▲图5 个体主要轨迹的UMAP可视化分析
 
05
重建骨骼肌细胞生成
为了更详细地研究发育过程,作者专注于在E9.5之前形成不同中胚层谱系的肌肉的发育上。作者使用Monocle 3构建了骨骼肌细胞生成特异性的轨迹(图6)。上海其明信息技术有限公司

本文作者还建立了一个网站(网址:http://atlas.gs.washington.edu/mouse-rna)免费提供他们的MOCA和底层数据。大家可以上去看一下,小编亲测,不用翻墙。 

单细胞测序大家都在做,但是能发超高分也不容易。小编发现发了顶级期刊的那些文章,大多都测了超大量的单细胞。就像文中作者就测了200万个细胞,使用的是组合标签法测序。

那么,组合标签法测序是如何测到高达200万个细胞的呢?这里小编结合本文献给大家讲一讲,

01
第一步
首先将细胞分配到4ⅹ96孔板中,在不同孔之间使用不同的标签(barcode/index)标记。这样,同一个孔的细胞带有同样的标签,不同的孔的细胞带有不同的标签。
这里,相信大家已经明白“组合标签法”中的“标签”的意思了,接下来给大家解释“组合”。
02
第二步
将上一步已经加过一轮标签的细胞从4ⅹ96孔板中收集起来,对这些细胞混合均匀之后,重新分配到4ⅹ96孔板中,再加一轮标签。在这个新的96孔板中,同一孔中新加的标签是相同的,但不同孔中新加的标签是不同的。如此一来,每个细胞就有了独一无二的标记(即:组合标签)。
▲图6如图所示, 96孔板中,不同的颜色代表用不同标签标记的细胞。最后,经过三轮加标签,每个细胞都带上了独一无二的“组合标签”。

但是,聪明的你肯定马上会产生这样的疑问,按照上面的方法只能产生4ⅹ96ⅹ4ⅹ96=147,456种不同的组合标签,作者一次测200万个细胞是如何做到的呢?
03
第三步
其实很简单,想要测更多的细胞,只需要重复“步骤2”,将上一轮4ⅹ96孔板中的细胞收集、混合、重新分配到新一轮的8ⅹ96孔板上、再次加标签,就能产生4ⅹ96ⅹ4ⅹ96ⅹ8ⅹ96=113,246,208种不同的标记。同时根据测试结果,“组合标签数目”比“待测细胞数目”多两个数量级以上时,发生细胞撞车的概率是极低的。因此,上亿种组合标签来标记200万个细胞还是非常容易区分开来的。
经过小编以上的讲解,你明白作者是如何做到200万个细胞只做一次实验的了吗? 

接下来,小编要再给大家介绍一下将该技术成功商用的“ICB-scSeq”单细胞测序技术!

ICB-scSeq(智能组合标签单细胞测序技术,Intelligent combinatorial Barcoding-single cell Sequencing),其将细胞分配到96孔板或者384板中,然后收集之后再分配,在分配细胞的同时给细胞加上组合标签,通过四轮组合标签最终使每个细胞带有独特的组合标签,从而将单细胞区分开来。

“ICB-scSeq”技术加上其明信息14年生信分析经验为您的单细胞研究保驾护航!

 

References:

  1. J. Cao, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature, 566, 496-502(2019). ( DOI:10.1038 / s41586-019-0969-X)
  2. 单细胞测序扫盲:是什么?为什么?怎么做?https://zhuanlan.zhihu.com/p/28844468
  3. 超过1000人观看的“ICB-scSeq”发布会直播视频来啦~
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本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

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