单细胞测序

这么多单细胞测序平台,我该选哪个?

单细胞测序领域自从2009年开始,在这十年以来不断持续着爆发式的发展和普及,这其中最大的推动力就是科研人员们对单细胞通量持续挑战,以及成功将这些技术进行商业化普及给一般用户的平台。
单细胞测序在发展的过程中遇到了两大技术难点,其一就是扩增技术。一般情况下,哺乳动物单个细胞的总RNA含量为1~50 pg,在这之中mRNA的含量就更少了,只占总RNA比值5%左右。因此,mRNA必须在被反转录成cDNA后,扩增至足以进行NGS测序的含量。这个技术难点并没有阻碍单细胞测序发展的步伐太久,扩增技术在研发的过程中逐渐成熟,从最初的PCR扩增(SMART-SEQ2等)到IVT扩增(CEL-SEQ2等),到现在的高保真DNA聚合酶扩增(SPLIT-SEQ等)。科研人员成功地建立了稳定的单细胞建库流程。然而另一个难点就没有那么容易逾越了。
从图中单细胞技术发展史能够看到,单细胞测序在很长的一段时间内都无法逾越细胞通量的限制。而且初期的技术成本都很高,对于实验人员的要求也不低,所以单细胞测序一直不为大众所知。
SMART-seq
SMART-seq可能是最为人知的单细胞测序技术了,2014年“升级换代”成SMART-seq2后,成为几乎每个单细胞测序公司都使用过的方法,直到现在还有许多厂商在制造SMART-seq2的试剂盒。大家熟悉的宝日医生物公司(TAKARA)就是其中之一。
虽然说SMART-seq2并不像其它技术一样被平台化,但作为试剂盒来说可能比仪器的受众客户要多得多。
使用起来难度也小,除了样本需要自己进行手工挑选以外,之后的步骤和常规的mRNA测序试剂盒相比没有额外的难点,使用的仪器耗材也大致相同。小结一下Smart-seq2,优点:

  • 细胞分选为人工操作法,较为灵活,可根据实验环境制定最优的细胞分选protocol;
  • 对样本需求量较低(穿刺样本即可);
  • 质控点多,可从实验的开端判断细胞状况;
  • 获得mRNA全长数据,基因检出率高。

缺点:

  • 人工技术要求极高;
  • 通量低、成本高;
  • 实验周期长(96个细胞至少需一周左右)。

适用范围:

  • 有长期细胞实验经验的科研人员;
  • 微量细胞样本(如胚胎细胞样本、CTC等),适用于深入研究。
Fluidigm C1
真正第一个实现商业化的平台是富鲁达(Fluidigm®)的Fluidigm C1平台。该公司使用的integrated fluidic circuits(IFCs),也就是微流控芯片技术能够一次上样的细胞数为96个左右。C1平台成功的商业化使得更多人能够涉足单细胞测序领域。
使用微流控技术进行细胞捕获,不仅解放了实验人员的双手,也降低了单细胞测序的门槛。给完全没有接触过细胞实验的客户一个稳定的样本捕获方案。
从下图中的说明可以看到,C1能够在几小时内捕获96个左右的细胞,允许捕获的细胞直径在5-25μm的范围内,最终能够得到细胞的全转录组信息。
C1虽然实现了仪器分选,但细胞通量仍然未破百。通常黄豆大小的组织样本中就起码含有10的6次方以上的细胞数,从百万数量级的细胞群体中只检测不到一百个细胞的话,很显然结果精确度和可靠性是远远不足的。总结一下Fluidigm C1,优点:

  • 稳定的细胞捕获平台,可同时捕获至多96个细胞;
  • 人工技术要求较低;
  • 实验周期短(96个细胞只需数小时);
  • 获得mRNA全长数据,基因检出率高;
  • 缺乏质控点。

 

缺点:

  • 细胞通量低;
  • 成本较高。

 

适用范围:

  • 少量样本研究;
  • 直径在5-25μm的细胞。
10x Genomics
而在2017-2018年,商业化的测序平台(10X Genomics®, BD Rhapsody®)出现,最终让Single-Cell测序技术走进了民用市场。这两种技术实现了细胞通量的飞跃,并且大幅降低了单细胞测序的成本。相对于Smart-Seq技术在细胞数量上的问题,BD和10X这两个平台普遍提供的细胞数量都在1,000—20,000区间,这个量级的测序细胞量已经可以覆盖绝大部分组织的Single Cell群体类型。因此,这两种技术在进行准确细胞分型的层面上,无论是从细胞数量上来说还是表达检测可靠性来说,都会更实用。
10X Genomics起源自Drop-Seq技术,含有 Barcode 信息的 Gel beads 在微流体“双十字”交叉系统的第一个进样口与样品和酶的混合物混合;在微流体“双十字”交叉系统的第二个进样口与油表面活性剂结合形成 GEMs,通过这样的过程实现单个细胞的捕获。
10X是到目前为止商业化最成功的平台。在主流高IF期刊上有可信的数据发表,并且都与Smart-Seq数据的结果存在比较,因此10X是可用可信的大规模Single Cell RNA-Seq技术。
但因为是仪器平台,所以和C1一样对能够上机的细胞大小有着严格的规定。小结10X Genomics,优点:

  • 通量高,平台成本低;
  • 操作简便;
  • 流程自动化程度高;
  • 支持文献数量多。

 

缺点:

  • 对细胞总量及活性要求较高,需仪器上门服务;
  • 3’测序,基因检测率不及SMART-seq等全长测序;
  • 缺乏质控点;
  • 平台环境较为封闭,个性化研发成本较高。

 

适用范围:

  • 直径40μm以下细胞(受仪器管道直径限制);
  • 大规模细胞样本,适用于分群、谱系等研究。

 

 

BD Rhapsody
比10X晚一年发布的BD Rhapsody平台源于Cytoseq蜂窝板技术,采用20W+的微孔(远超过细胞数量,目的就是为了一孔一个细胞),因此可以叫做“微孔捕获”,效率会相对更高一些。捕获后也是裂解细胞,再进行mRNA抓取。
BD最显眼的就是它充满科技感的大屏幕。通过这个屏幕,实验人员可以实时监控细胞的捕获情况。避免了传统仪器上机之后只能一条路走到黑的窘境。
从发布时间来看,10X发布更早,而BD发布在其1年之后,这点上10X Genomics的设备稍占优势。而在国内生物公司公布的捕获效率(~79%)来看,BD Rhapsody的捕获效率更高较占优势(10x官方捕获率为65%)。小结一下BD Rhapsody,优点:

  • 平台成本低,通量高;
  • 可通过屏幕监控进行细胞质控;
  • 平台较为开放,利于个性化研发(靶向捕获)。

 

缺点:

  • 对细胞总量要求较高;
  • 为3’测序,基因检测率不及SMART-seq等全长测序;
  • 操作步骤较多。

 

适用范围:

  • 直径<20μm的细胞(受磁珠结合效率限制)。
  • 大规模细胞样本,适用于分群、谱系等研究。

 

 

ICB-scSeq
这两年来,得益于10X成功的商业宣传,单细胞测序被普及至民用市场。虽然BD也有后来居上的势头,但单细胞领域几乎还是10X的天下。并不是因为没有更新、更好的技术被发明出来。而是因为没有公司能将前沿的技术商业化成稳定的平台。例如从2017年开始出现的新想法:组合标签技术。

第一篇将组合标签法带入大家视线的,是2017年3月发表在Nature Methods的上文章:Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing。

文章中使用了一种组合index的方法:Single cell Combinatorial Indexed Sequencing (简称SCI-seq) ,对16,698个不同来源的细胞进行了CNV检测。

第一轮barcode通过转座酶连接,第二轮barcode通过PCR连接。通过这样96X96的标签组合,理论上一次可以区分的细胞数量在9,216个。这个技术本身不是横空出世的创新理念,而是把已有的思想嫁接到单细胞测序领域,而且细胞的通量并没有很吸引人,所做的也不是大家最关心的单细胞RNA测序。所以并没有掀起什么大风浪。然而第二年在Science上发表的SPLIT-seq,这项技术甚至使得当时的一些仪器厂商开始“放血让利大甩卖”。SPLIT-seq本身的想法和sci-seq类似,通过大量的标签组合对细胞进行区分。
这篇文章使用了4轮标签,超过600万以上的排列组合,成功鉴定了156,049个细胞。之所以能够引起大家强烈的关注,第一个原因是SPLIT-seq一个批次就能做15万以上的细胞,这个通量实在是远远超出一般想象。第二个原因就是这个方法实现大通量scRNA-seq的过程中完全不需要用到定制仪器,而且就整体的操作层面来看似乎并没有太多难点。不用买仪器就能做到十几万通量的单细胞测序,这一点实在是太诱人了。
想要将这个方法进行商业化的公司也不在少数,但至今为止发布组合标签法测序的公司只有一家。为什么这么好的方法大家不抢着赶紧研发呢?其实这里面是有很客观的原因的。首先,没有二代测序、单细胞建库实验、生信分析基础的公司,是不具备将这个方法商业化的能力的。这个方法虽然看似没什么特别的难点,但却是属于正宗的“一看就会,一做就废”型的实验。其次,由于10X Genomics成功的宣传推广,具备一定实力的公司大多买了10X的仪器,有些甚至还顺势购买了BD仪器。这些公司不仅不会再开发新技术,并且甚至对于新技术的出现感到十分恐惧。毕竟已经买了仪器入了坑,总不能直接被淘汰放在仓库里积灰吧。最后,就是研发的投入产出性价比。毕竟就算成功开发出一个稳定的新产品,要被大众所接受还是得花上一定时间的。所以比起创新,可能还是乖乖买台仪器比较稳妥,起码是已经被广泛接受的产品,有官方厂家撑腰。

这种种的原因就造成了如今正式发布以组合标签法思想进行单细胞测序的产品的公司,只有上海其明信息技术有限公司这一家。客观的讲,虽然其明信息确实是靠着自己的实力和坚定不移的战略思想站在了单细胞测序新时代的最前沿,但造成这个现实的一部分原因还有其它公司都放弃、甚至根本不愿意从保守的定制化仪器时代踏入一个全新的领域这一点。

其明信息的ICB-scSeq虽然是一个新产品,必定还存在着发展的空间,但是经过了大量的实验、测试和优化,ICB-scSeq是现在唯一一个能够运用组合标签法进行稳定建库的产品。

通过对样本固定方法和过程的不断摸索,其明信息生产了专门用于ICB-seq样本固定的试剂盒。从过筛、染色、固定到细胞计数都可以仅凭这一款试剂盒完成。
在建库方面,有很多公司都在尝试将其稳定化,但是几乎都以失败告终。参考文献中的步骤能够模仿,但是实验环境和仪器试剂大家都各不相同。尤其是引物和试剂方面,各国的制备工艺都不同,只是照搬文献内容的话失败几率极高。其明投入了大量的人力物力,重新设计了一套的引物、优化各环节的实验条件,大大提升了标签的连接效率,并且最大程度降级了实验中对样本的损耗。通过这样的对策,ICB-scSeq对于细胞的捕获率从测试初期的惨不忍睹到了如今基本接近文献中公布的数据(捕获率97.5%)ICB-scSeq(组合标签法)小结,

优点:

  • 通量高,平台成本低;
  • 一次处理样本数多;
  • 捕获率高;
  • 样本要求低。

 

缺点:

  • 为3’测序,基因检测率不及SMART-seq等全长测序。

 

适用范围:

  • 大规模细胞样本,适用于分群、谱系研究;
  • 微量细胞样本(如胚胎细胞、CTC等),适用于深入研究;
  • 直径<100μm的细胞
以上就是现有的单细胞测序技术的总结与比较,大家可以根据自己的需求进行选择适合自己的单细胞测序技术。
名称:上海其明信息技术有限公司地址:中国(上海)浦东新区李冰路151号
邮箱:service@gcbi.com.cn网址:www.gminix.com
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本文由 GCBI学院 作者:Lina 发表,转载请注明来源!

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