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文献解读丨ceRNA研究最关键的一步怎么做,你知道吗?

近几年,ceRNA的研究可谓是如火如荼,各种高分文章满天飞,到了18年热度依旧不减,今年国自然中标45项,中标金额为:1818万。下面是国自然中标图:

那么ceRNA是什么呢?各位老伙计肯定已经知道了,这里给科研萌新们简单科普一下。

ceRNA(competing endogenous RNAs,竞争性内源RNA)假说是指一种全新的基因表达调控模式,我们已知miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默,而ceRNA(lncRNA、circRNA...)可以通过竞争性结合miRNA来调节基因表达,从而影响细胞的功能。

 

下面简单总结一下ceRNA 研究的常见分类

  1. ceRNA关系对的获取及基本qPCR分析
  2. ceRNA关系对中各成分与疾病相关性的研究
  3. ceRNA关系对中的竞争性关系的验证

发现了没,研究ceRNA就要先找ceRNA关系对,如:lncRNA-miRNA-mRNA,再结合具体情况进行后续研究。

下面小编给大家拿2018年12月5日最新发表在Cell Death&Disease上的一篇文献做介绍:

  • 文章标题:Long non-coding RNA C5orf66-AS1 promotes cell proliferation in cervical cancer by targeting miR-637/RING1 axis
  • 发表期刊:Cell Death&Disease
  • 影响因子:638

研究思路

研究者通过使用癌症基因组图谱(TCGA)筛选鉴定宫颈癌和癌旁组织中差异表达的lncRNA,并通过实时定量PCR验证候选lncRNA,发现lncRNA C5orf66-AS1在宫颈癌组织和细胞中显著上调。

后续证明了LncRNA C5orf66-AS1作为竞争性内源RNA(ceRNA)通过吸附miR-637调节RING1影响宫颈癌细胞增殖、凋亡和细胞周期,为研究发病机制和探索宫颈癌的有效治疗靶点提供了新的理论和实验基础。

研究结果

1.目标lncRNA的确定及qPCR验证

研究者从TCGA下载并分析了三对宫颈癌和癌旁组织中lncRNA的测序数据,选择其中10种差异表达的lncRNA进行qRT-PCR,结果显示,ENSG00000249082(C5orf66-AS1)在宫颈癌组织中显著高表达。

2.验证lncRNA与疾病的相关性

为了研究LncRNA C5orf66-AS1表达变化对宫颈癌细胞增殖的影响,对其进行过表达/沉默,结果显示C5orf66-AS1的过表达促进了宫颈癌细胞的增殖,而C5orf66-AS1的下调促进了宫颈癌细胞的凋亡。

3.miRNA确定及与lncRNA的关系

研究者通过RegRNA2.0数据库发现C5orf66-AS1可通过互补碱基配对与miR-621,miR-637,miR-663b,miR-3184,miR-3187,miR-4449,miR-4706和miR-5001相互作用。因此,假设C5orf66-AS1充当这些miRNA的海绵。

使用免疫荧光报道分子测定法在SiHa细胞中进一步验证C5orf66-AS1与候选miRNA的结合能力,选取miR-637作为候选miRNA,并通过qRT-PCR实验、双荧光素酶检测、RIP检测到C5orf66-AS1的下调显著促进miR-637的表达,而C5orf66-AS1的上调显著降低了miR-637的表达。

 

 

4.miRNA靶基因的确定(RING1

根据TargetScan和miRDB数据库选取SLC8A2,SPRED3,TSPAN11,MNT,PVRL1和RING1用作候选靶基因,经过免疫荧光报告等多种证据确定RING1 可以直接与miR-637结合。

5.lncRNA通过miR-637/RING1调节癌细胞的增殖

此外,免疫荧光报告测定的结果显示,在SiHa和C-4 I细胞系中上调或下调C5orf66-AS1后,RING1在mRNA和蛋白质水平的表达分别显着增加或降低。这些结果表明C56orf66-AS1、miR-637 和RING1在ceRNA机制中共同作用

6.进一步研究lncRNA的功能

为进一步研究C5orf66-AS1在宫颈癌发生发展中的重要生物学功能以及C5orf66-AS1对宫颈癌细胞增殖的影响,研究者建立了裸鼠宫颈癌皮下移植瘤模型。结果显示, C5orf66-AS1-siRNA组的皮下肿瘤体积开始明显变小,且在C5orf66-AS1-siRNA组中,miR-637的表达显著增加,而RING1的表达显着降低。此外,免疫组织化学分析结果分析也表明下调lncRNA C5orf66-AS1抑制体内肿瘤生长。

了解过ceRNA的研究思路之后,下一个问题就来了。

想研究ceRNA,先要获得ceRNA关系对,这么多层面的数据如何获得呢?

方案1.公共数据分析。公共数据分析想必各位都不陌生了,各大数据库拥有海量的数据可供分析研究。前提是生信基础要好。

方案2.二代测序/基因芯片。想要自己的数据当然还是做二代测序或者基因芯片。

但是,每种RNA都要测次序/做一张芯片吗?!

费时费事费样本,有没有更好的方法呢?

当然有!小编在这里给大家推荐上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程中心研发团队自主研发的SBC ceRNA芯片同时覆盖circRNAlncRNAmRNA,一张芯片可以得到3个层面的表达信息,让你一张芯片就能玩转ceRNA研究。

SBC ceRNA芯片

SBC ceRNA芯片是?

SBC ceRNA芯片是一个全转录组+产品,不仅同时检测circRNA、lncRNA等非编码RNA和编码蛋白的mRNA,并同时获得circRNA、lncRNA功能预测结果,为进一步功能研究提供参考。circRNA、lncRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA),竞争性结合miRNA,从而调控miRNA靶基因的表达,这样的作用方式广泛存在,ceRNA芯片也同样是ceRNA研究的不二之选。

SBC ceRNA芯片的优势

  • 稳定:SBC在国内最早从事基因芯片研发,设计经验丰富,委托Agilent公司生产,检出率高,技术重复性高于99%;
  • 超值:芯片覆盖circRNA、lncRNA、mRNA,一份芯片数据同时提供三个层面的表达信息;
  • 特异性高:circRNA探针设计在反向剪切位点,保证每个探针检测的特异性,避免与母基因之间的冗余影响;
  • lncRNA优化选择:收录高可信度lncRNA,包括:CAGE-seq鉴定具有高可信度5'TSS 及RNA-seq数据证实在多种组织、细胞中表达
  • 快速:实验周期短,数据分析方法成熟、快速

芯片设计策略

 

技术参数:

物种 小鼠
芯片名称 SurePrint G3 Human ceRNA Microarray SurePrint G3 Mouse ceRNA Microarray
格式 4x180K 4x180K
circRNAs

探针个数

84569 49175
lncRNA transcripts

探针个数

72002 78264
Super enhancer lncRNAs

探针个数

17652 8024
coding transcripts

探针个数

18793 21611
数据库来源 NCBI、UCSC、Ensembl、Gencode、lncpedia、lncrnadb、NONCODE、circBase NCBI、UCSC、Ensembl、lncrnadb、NONCODE、RNAcentral、 circBase、circpedia、TSCD

Reference:

1.https://www.nature.com/articles/s41419-018-1228-z#Sec8

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本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

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