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答疑呀嘿丨如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性?

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答疑专栏一不小心就做了十一期,非常非常非常感谢每周进行答疑的老师们!

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关于专栏你们有什么想说的,有什么要吐槽的,有哪里要改进的.....请留言告诉小编。

先看本周问题

Q1qPCR

问:如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性?

答:

  1. 确定模板RNA 完整性,无DNA污染;
  2. RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂;
  3. 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin;
  4. 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱;
  5. 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果;
  6. 设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。

Q2GCBI

问:请问什么时候能出个GCBI的使用教程啊,真心没什么时间自己研究啊

答:GCBI的教程可不是一个,而是好多好多个。小编已经整理成目录,下面是打开方式:

  1. 复制下面链接,用浏览器打开即可查看;链接:http://college.gcbi.com.cn/helpme
  2. 电脑登陆“GCBI学院”,进入“GCBI帮助中心”即可查看。

Q3-生信分析

问:通过正常组与疾病组RNA测序后进行差异表达分析,筛出来后进行GO注释得到的转录因子是否可以认为是关键转录因子?

答:不可以。转录因子的作用一般不是通过基因表达量的差异体现的,而是与入核机制,和启动子结合等调控功能有关,所以在疾病中研究转录因子主要是chip-seq或者RNA pull down -MS。

如果没有已知的相关研究报道,也可以通过ATAC-seq和RNA-seq联合分析来筛选可能的转录因子,最后通过chip-seq来确认。

Q4-高通量测序

问:做完测序后续还需要做哪些实验?

答:测序分析完成后,客户根据结果挑选目标基因或目标位点进行验证,验证符合后可以进一步做扩大样本验证和功能实验。

Q5-生信分析

问:分析结果中实验组某一样本的表达值与同组差异较大,不在均线,质检合格,是测序还是样本处理有问题,或者其他问题?

答:如果样本是同一批次处理的,存在差别时,一般是因为样本准备的问题;其次在测序之前,可以通过抽提的RNA质量和文库质量来判定样本之间的差别。

Q6-生信分析

问:启动子promoter区怎么预测吗?有什么推荐的网站或软件吗?

答:模式生物的话,比如人, 一般就是指起始密码子上游1-3Kb 的区域,推荐工具:https://molbiol-tools.ca/Promoters.htm

Q7-数据库

问:有gene symbol和蛋白名称对应的数据库吗,想做二者的转换

答:uniprot数据库。网址:

https://www.uniprot.org/

本期答疑结束

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