答疑呀嘿丨转录组测序结果老不好，多半是？

“答疑呀嘿”时间到！

首先感谢本周答疑老师-上海其明的孔老师，侯老师，陈老师，杨老师！

本周问题，请下拉！

Q1－转录组测序

问：转录组测序结果总不好，为什么呢？

答：转录组测序的影响因素有很多，最基础的：

1. RNA的降解会严重影响测序的质量：若RNA的3'端发生降解，则无法通过3'端的poly A尾捕获mRNA，反转录后进行测序也无法得到全部的cDNA；若RNA的5'端发生降解，通过3'端的poly A捕获得到mRNA，测序结果将出现明显的3'和5'偏好。
2. RNA的起始量不足会影响测序的质量：RNA起始量不足时，需要增加PCR扩增循环数才能获得足够的量用于后续测序，这会产生大量的冗余数据。

 

Q2－qPCR

问：想请问一下qPCR做标曲时的标准品是指的什么？跑了温度梯度后的产物进行系列稀释还是逆转录后的cDNA？

答：标准品一般是用于绝对定量的qPCR实验，标准品的构建是通过TA克隆的方法获得目的基因的重组质粒，经过等比稀释得到10（0次方）-10（7次方）的拷贝数梯度的DNA。

 

Q3－公共数据分析

问：geo下载了series matrix文件，是illumina芯片，矩阵value有负值有几万的值，上传者说数据按照cubic spline 标准化，想找差异基因做热图的话，想问接下来怎么处理呀？（差异基因已经通过geo2r找到并且根据p和logfc筛出了）

答：已经筛选好差异基因，接下来直接用筛选好的差异基因的标准化数据做Heatmap。

 

Q4－高通量测序

问：请问在用细胞样本做二代测序后发现比对到基因组上时mapping率很低,可能的原因是哪些?

答：

1. 可能是物种混淆。比如本来应该是人的细胞,不小心跟小鼠的细胞搞混,这个时候该样本比对到人基因组上的mapping率肯定会低;
2. 还有可能是在细胞培养过程中造成了杂菌污染。杂菌污染包括细菌、霉菌、病毒以及支原体污染，前几种污染在细胞培养的过程中很容易被发现，比如培养基浑浊、细胞停止生长或者出现很多肉眼可见的霉菌等；但当支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视，所以发生支原体污染的可能性非常大。

当遇到这样的情况，建议首先排查样本物种混淆的情况，确认物种没有混淆之后，最好对所有的细胞样本进行一次支原体检测。

 

Q5－多基因雷达

问：GCBI网站-多基因雷达中相关转录因子是如何得到的？原理是?

答：相关转录因子是依据基因在Pubmed，Transfac数据库中收录的有文献依据的基因与转录因子的关系，从而构建相关转录因子的网络。

详细可见链接：http://college.gcbi.com.cn/archives/2439

 

Q6－生信分析

问：覆盖率是什么？覆盖深度是什么？测序深度和基因组覆盖率的关系如何？

答：覆盖率（breadth of coverage），指被测序到的碱基占全基因组大小或者目标区段大小的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域。

覆盖深度（depth of coverage、覆盖度），是指平均碱基测序深度，即每个碱基被测序的平均次数（测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值）。

测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。

 

Q7－高通量测序

问：高通量测序中常常看到cDNA，请问到底是指什么？

答：cDNA：complementary DNA，互补脱氧核糖核酸，与RNA链互补的单链DNA，以RNA为模板，在反转录酶的作用下所合成的DNA。

 

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