答疑呀嘿

答疑呀嘿丨转录组测序结果老不好,多半是?

“答疑呀嘿”时间到!

首先感谢本周答疑老师-上海其明的孔老师,侯老师,陈老师,杨老师!

本周问题,请下拉!

Q1-转录组测序

问:转录组测序结果总不好,为什么呢?

答:转录组测序的影响因素有很多,最基础的:

  1. RNA的降解会严重影响测序的质量:若RNA的3'端发生降解,则无法通过3'端的poly A尾捕获mRNA,反转录后进行测序也无法得到全部的cDNA;若RNA的5'端发生降解,通过3'端的poly A捕获得到mRNA,测序结果将出现明显的3'和5'偏好。
  2. RNA的起始量不足会影响测序的质量:RNA起始量不足时,需要增加PCR扩增循环数才能获得足够的量用于后续测序,这会产生大量的冗余数据。

 

Q2qPCR

问:想请问一下qPCR做标曲时的标准品是指的什么?跑了温度梯度后的产物进行系列稀释还是逆转录后的cDNA?

答:标准品一般是用于绝对定量的qPCR实验,标准品的构建是通过TA克隆的方法获得目的基因的重组质粒,经过等比稀释得到10(0次方)-10(7次方)的拷贝数梯度的DNA。

 

Q3-公共数据分析

问:geo下载了series matrix文件,是illumina芯片,矩阵value有负值有几万的值,上传者说数据按照cubic spline 标准化,想找差异基因做热图的话,想问接下来怎么处理呀?(差异基因已经通过geo2r找到并且根据p和logfc筛出了)

答:已经筛选好差异基因,接下来直接用筛选好的差异基因的标准化数据做Heatmap。

 

Q4-高通量测序

问:请问在用细胞样本做二代测序后发现比对到基因组上时mapping率很低,可能的原因是哪些?

答:

  1. 可能是物种混淆。比如本来应该是人的细胞,不小心跟小鼠的细胞搞混,这个时候该样本比对到人基因组上的mapping率肯定会低;
  2. 还有可能是在细胞培养过程中造成了杂菌污染。杂菌污染包括细菌、霉菌、病毒以及支原体污染,前几种污染在细胞培养的过程中很容易被发现,比如培养基浑浊、细胞停止生长或者出现很多肉眼可见的霉菌等;但当支原体污染细胞后,培养液可不发生混浊,多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解,因此易被忽视,所以发生支原体污染的可能性非常大。

当遇到这样的情况,建议首先排查样本物种混淆的情况,确认物种没有混淆之后,最好对所有的细胞样本进行一次支原体检测。

 

Q5-多基因雷达

问:GCBI网站-多基因雷达中相关转录因子是如何得到的?原理是?

答:相关转录因子是依据基因在Pubmed,Transfac数据库中收录的有文献依据的基因与转录因子的关系,从而构建相关转录因子的网络。

详细可见链接:http://college.gcbi.com.cn/archives/2439

 

Q6-生信分析

问:覆盖率是什么?覆盖深度是什么?测序深度和基因组覆盖率的关系如何?

答:覆盖率(breadth of coverage),指被测序到的碱基占全基因组大小或者目标区段大小的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域。

覆盖深度(depth of coverage、覆盖度),是指平均碱基测序深度,即每个碱基被测序的平均次数(测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值)。

测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系,测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。

 

Q7-高通量测序

问:高通量测序中常常看到cDNA,请问到底是指什么?

答:cDNA:complementary DNA,互补脱氧核糖核酸,与RNA链互补的单链DNA,以RNA为模板,在反转录酶的作用下所合成的DNA。

 

以上就是本周的问题,你对这些问题有什么想法?或者你有什么问题?

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