答疑呀嘿丨为什么分析到的差异表达基因与qPCR实验结果不一致？

又是一周答疑呀嘿时间到！

上周，你提了什么问题呢？

本周请了实验室的孔老师、生信分析部的谢老师和杨老师来回答大家的问题，感谢他们！

接下来，找一找你的问题与答案吧！

Q1－生信分析

问：接上期，基因组注释分析主要包括哪些内容？

答：基因组注释包括以下方面的内容：

1. 重复序列的预测。通过比对已知的重复序列数据库，找出序列中包含的重复序列，识 别类型并转化为 N 或者 X，统计各种类型重复序列的分布。
2. 编码基因的预测。通过将转录组或 EST 数据比对到拼接后的基因组序列上，找出编 码基因位置， 预测编码基因结构。 或者通过专业的外显子预测软件， 预测编码基因的外显子结构。
3. 小 RNA 基因的预测。通过比对已知的小 RNA 的数据库，或者通过生物信息学软件预 测，找出这些小 RNA 基因，并进行分类。
4. 调控序列和假基因的预测。 基因功能的注释，使用的数据库包括 NT/NR, SwissProt/TrEMbl, InterPro, KEGG, COG, Gene ontology 等，使用比对的方法，如 blast，找出同源相近的基因，并注释功能。

Q2－PCR

问：跑出来的条带拖尾是什么原因？谢谢解答

答：拖尾的可能原因：

1. 模板不纯。建议纯化模板
2. buffer不合适。建议更换buffer
3. 退火温度偏低。建议适当提高退火温度
4. 酶量过多。建议适量用酶
5. dNTP，Mg2+浓度偏高。建议适当降低浓度
6. 循环次数过多。建议减少循环次数。

Q3－外显子组测序

问：什么是外显子组测序？

答：外显子组测序（whole exon sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集侯进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

Q４－ｑPCR

问：为什么分析到的差异表达基因与qPCR实验结果不一致，无法被验证？

答：RNA-seq是大规模筛选用的，反应样本整体的基因表达变化趋势，但不能保证每一个基因的变化趋势都与qPCR保持一致。RNA-seq与RT-PCR本身就是两种不同的实验平台，两者不能一一对应。一般是挑选大量的基因验证，两者的结果从统计学上来说存在较高的相关性（r2>0.8），视为验证成功。

Q5－生信分析

问：lncRNA没法做GO、KEGG怎么办？差异lncRNA又太多怎么做靶基因？

答：可以进行lncRNA的cis作用靶基因预测和Trans作用靶基因预测，cis调控就是指非编码RNA对临近mRNA的一种转录激活与表达调控方式，而trans相反，则是对远端mRNA转录的调控。取lncRNA靶基因与差异基因的交集方可缩小范围，进而再对lncRNA靶基因进行GO_pathway分析，从而了解lncRNA的功能。

Q6－生信分析

问：这句话对芯片探针通过blast+重注释是什么意思呢？是对探针序列重新注释么？那么重新注释出来的结果会不会和之前平台注释文件结果一样呢？

是不是所有的GEO芯片的探针序列都可以用blast+来重新注释呢？尤其是那些芯片注释平台文件没有genesymbol等基因信息的。

答：首先，在芯片中，探针是一段与目标基因能够靶向互补结合的序列，在affymatrix 芯片中，由于注释库文件更新不是很及时，导致有些基因或者lncRNA的注释不全或者目前已经有更新的注释，在这种情况下，是可以使用blast+等软件对探针序列进行比对，目的就是看该探针能够比对到的基因组区域目前是什么注释信息，比对可能比对到一个刚刚注释的一个新的lncRNA，这样，该探针的信号强度就可以代表这个lncRNA的表达值。

其次，理论上，所有探针都可以通过这样的方式进行重新注释，但是大多数蛋白编码基因，芯片本身的注释库一般是比较全的，变动也不会频繁，主要是一些非编码基因可以推荐使用这个方法，可能这也是问题中引用的文献中，对lncRNA进行重注释的原因。

Q7－生信分析

问：怎么理解GO/KEGG富集分析？

答：富集分析是将功能类似的基因集通过统计学检验算法富集到一起，从而方便研究具有某一类功能的基因，更快的获取研究相关的功能基因。

Q8－ｑPCR

问：lncRNA如果需要进行验证，引物设计怎么处理？

答：lncRNA最短的长度是200nt，可满足荧光定量PCR（100-200nt目的片段）的要求。不过由于lncRNA的保守性比较低，组织特异性比较强，扩增效率比较低，可能需要设计多对引物进行尝试。

以上就是本周的问题了！

你有什么见解，欢迎下方或后台留言给我们。

可能回得有点慢，但一定会回复的！

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