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研究lncRNA?发5分文章的套路送给你!

之前小编介绍了一篇研究lncRNA的发表在science上的文章,后台有小伙伴吐槽“science太遥远,还是让我发个5分文章先!”

5分文章难吗?掌握好套路,其实也没那么难。

今天小编就以一篇今年5月23日发表在Cell Death and Disease(IF=5.638)上的一篇文章为例来总结一下5分文章的套路。

先看一下文章标题,完全包含了文章的四要素:分子、表型、机制、疾病。

期刊详情

期刊名称:Cell Death & Disease

影响因子:5.638

一审周期:1.5月

所属国家:英国

研究方向:肿瘤、干细胞、细胞凋亡

中科院分区:大类:生物2区,小类:细胞生物学 3区

杂志主页:https://www.nature.com/cddis/

期刊投稿网址:http://mts-cddis.nature.com/cgi-bin/main.plex

研究背景

作者的思路非常清晰,介绍了自己选择研究的疾病、lncRNA H19的原因。

  1. 颞叶癫痫(TLE)是最常见的顽固性癫痫类型之一,其特征在于海马神经元损伤和海马硬化。长非编码RNA(lncRNA)已越来越多地被认为是转录后调节因子。然而,他们在TLE中的表达水平和功能仍然很大程度上未知。
  2. 近年来,尽管miRNA的研究在癫痫发生中非编码RNA生物学领域占主导地位,但长链非编码RNA(lncRNA)的生物学功能也引起了越来越多的关注,然而迄今为止很少有研究探讨lncRNA在TLE中的功能。
  3. H19是第一个鉴定的lncRNA。H19除可作为致癌基因或肿瘤抑制因子之外,还参与其他几种生理状况和非癌症状态。在中枢神经系统中,H19在胶质母细胞瘤组织中显著过表达,并且其表达水平与患者存活相关。然而,H19在包括癫痫在内的非肿瘤性CNS疾病中的生物学作用仍然未知。

研究思路

本研究中,研究者使对TLE大鼠模型使用基因芯片分析来探索癫痫大鼠海马区中lncRNA的表达谱。功能获得和丧失的体内研究表明,H19的过表达加重了SE诱导的海马神经元凋亡,而H19的抑制作用可以保护大鼠免受SE诱导的细胞损伤。最后,结果表明H19可能作为竞争性内源RNA发挥作用,使海绵microRNA let-7b调节细胞凋亡。

文章结果

  1. 筛分子

为了探索与癫痫发生有关的lncRNA和mRNA的表达谱,将SE后1天的癫痫大鼠模型的海马用于基因芯片(Gene-Chip Rat Gene 2.0 ST Array ,Affymetrix, USA)分析。差异表达的阈值设定为lncRNA的倍数变化> 1.2,mRNA的倍数> 1.5。共发现313个差异表达的lncRNA,其中152个被下调,161个被上调。其中,H19是最上调的lncRNA,增加了8.1倍。同时,差异表达2612个mRNA,其中1361个被上调,1251个被下调。

  1. 生物信息学分析

本文作者选取的是表达谱中显著差异表达最大且在癫痫中功能未知的长链非编码RNAH19进行后续研究。

聚类分析显示假性和癫痫大鼠之间这些差异表达的mRNA(图1a)和lncRNA(图1b)的系统变异。

图1

功能注释和通路分析表明,差异表达的基因参与许多功能和途径,包括细胞凋亡(图2 c、d、e)

图2

根据特定表达基因的标准化信号强度构建的基因共表达网络显示H19与54 个蛋白质编码基因连接。(图 3)

图3

  1. qPCR验证

为了验证基因芯片分析结果,选择11个lncRNA(6个上调和5个下调)通过qPCR测试它们的表达水平,如图显示,11种选择的lncRNA在qPCR和基因芯片中发现的变化一致,表明本组lncRNA,尤其是H19,可能在癫痫发生中起重要作用。

图4

为了充分探索TLE不同时期的H19的表达模式,将杏仁核(KA)诱导的大鼠模型的杏仁核内注射用于H19表达的qPCR分析,得到了lncRNA H19 的表达模式,进一步证实了H19在癫痫潜伏期中的高表达。

图5

到了验证功能这里,一般就可以发1-3分的文章了。验证实验结束之后,可以根据情况来继续后面的研究,提高自己的分数。加上功能研究,一般可以发3-5分的文章。想发5分以上的文章,就必须加上分子机制的研究。本篇文章的作者就是按照这样的思路向下走的,来学习一下。

  1. 功能研究

接下来,作者通过H19过表达和使用腺相关病毒(AAV)递送系统的敲减实验来研究H19的体内生物学功能。脑切片上的荧光观察结果显示注射的载体融合到海马中(图6e)。qPCR结果证实,AAV-H19或AAV-shRNA的应用分别在海马的CA3子区中导致显著的H19高表达(图6f)或H19减少(图6g)。

图6

作者使用Nissl染色和Fluoro-Jade C(FJC)染色研究了在SE后第7天H19对大鼠海马神经元的作用。结果(图7)表明,H19在体内加剧了SE诱导的海马神经元死亡。

图7

由于功能注释和途径分析暗示凋亡信号传导途径可能参与SE诱导的损伤,因此检查与凋亡相关的蛋白质。如图8a所示,在SE后第7天,在大鼠的海马的CA3子区中也观察到显着升高的c-Casp3和p53以及降低的Bcl-2。

免疫荧光分析显示c-Casp3免疫反应物质位于海马CA3区的神经元中(图8b)。

进行实验以探究H19是否影响凋亡相关蛋白的表达水平。如图8c、d所示,H19过表达增加了c-Casp3,Bax和p53的蛋白质表达水平,并且降低了海马CA3亚区中Bcl-2的表达,并且H19敲低逆转了这些变化。

图8

  1. 分子机制

最近的研究表明,H19可以通过充当竞争内源RNA为miRNA的let-7的,导致通过靶向几种蛋白质编码基因的去阻遏调节基因表达的let-7的,作为H19窝藏两个典型和非let-7家族的典型结合位点。如图,各种数据表明,H19通过作为竞争性内源RNA靶向let-7b来调节Casp3表达,在SE诱导的海马神经元损伤中发挥重要作用。

总之,该研究揭示了一种新的lncRNA H19介导的癫痫发作诱导的神经损伤机制,并提供了基于lncRNA的减少癫痫发作引起的脑损伤的发展策略。

注:文中所用到的基因芯片(Gene-Chip Rat Gene 2.0 ST Array Affymetrix, USA)和生物信息学分析由上海其明信息技术有限公司提供.

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本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

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