答疑呀嘿丨为什么外泌体分离之后，还要做鉴定？

又是一周答疑时间，感谢本期抽出时间回答问题的老师：实验室的孔老师，生信部的谢老师、monkey 1老师。

接下来是本期问题：

Q1－ｑPCR

问：请问标准曲线扩增效率要在多少才合格，过高或过低该怎么办呢？

答：对于相对定量qPCR而言，扩增效率最低标准要在90%-110%之间，很好的扩增效率要在95%-105%之间。若不在这个范围，需要重新设计引物。

Q2－ｑPCR

问：提取细胞RNA做qPCR要不同组的细胞数量一样吗？如果没有一样有什么影响？

答：不需要，最终qPCR上样量是以RNA来衡量的，尽量保持总RNA上样量一致或者接近就可以了，这样扩增出来的内参的ct值会比较集中。

Q3－测序方案

问：只去掉核糖体RNA,解析mRNA+lncRNA+circRNA中得到的circ和circRNA-Seq(加入RNase R 去掉线性RNA) 得到的circ有什么差别吗？

答：前者很多都是线性RNA，circRNA的含量非常低，所以后者得到的circRNA的表达量会明显高于前者，对于后续分析，后者的结果准确性高！

Q４－外泌体

问：为什么外泌体分离之后，还要做鉴定？

答：现存的分离技术是根据外泌体的大小、结构和一些膜蛋白的捕获，很难完全将其与其他囊泡和大分子蛋白质复合体区分开，因此就需要对外泌体进行鉴定，证明你分离得到的是外泌体。

外泌体的鉴定主要依赖形态学特征（扫描电镜SEM、透射电镜TEM等电子显微镜）、颗粒粒径与浓度（纳米颗粒示踪分析NTA）、标志性蛋白（蛋白质印迹技术和流式细胞技术分析CD9、CD63、CD81、HSP90等）。

Q5－外泌体

问：样品在exosome （外泌体）提取前是否可以冻存？

答：可以。血样、尿样、体液等，需要攒齐了一起提取，或者同一个患者的样本多次提取。冻存前，首先要离心去除细胞和血小板，再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。

注：想了解更多外泌体的相关内容，欢迎查看：收藏|最全的“外泌体”研究视频，看完这些就够了

Q6－高通量测序

问：是否一定要求设置生物学重复以及重复次数？

答：目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后，遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复，那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验、FISH荧光原位杂交或Northern blot等实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，但是考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。

注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。

Q7－生信分析

问：常用软件featureCount和Htseq-count所统计的count是什么？

答：假设一个基因Gene1包含三个外显子exon1、exon2和exon3，测序数据经比对后，若exon1上比对到三条reads，exon2上比对到4条reads，exon3上比对到1条reads，那么Gene1的counts数为1+3+4=8。

Q8－生信分析

问：DESeq2怎么对counts进行差异显著性检验？

答：DESeq2 假设counts 服从一个负二项分布（negative binomial distribution），然后利用Wald test 进行差异显著性检验。

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