答疑呀嘿

答疑呀嘿丨为什么外泌体分离之后,还要做鉴定?

又是一周答疑时间,感谢本期抽出时间回答问题的老师:实验室的孔老师,生信部的谢老师、monkey 1老师。

接下来是本期问题:

Q1-qPCR

问:请问标准曲线扩增效率要在多少才合格,过高或过低该怎么办呢?

答:对于相对定量qPCR而言,扩增效率最低标准要在90%-110%之间,很好的扩增效率要在95%-105%之间。若不在这个范围,需要重新设计引物。

Q2-qPCR

问:提取细胞RNA做qPCR要不同组的细胞数量一样吗?如果没有一样有什么影响?

答:不需要,最终qPCR上样量是以RNA来衡量的,尽量保持总RNA上样量一致或者接近就可以了,这样扩增出来的内参的ct值会比较集中。

Q3-测序方案

问:只去掉核糖体RNA,解析mRNA+lncRNA+circRNA中得到的circ和circRNA-Seq(加入RNase R 去掉线性RNA) 得到的circ有什么差别吗?

答:前者很多都是线性RNA,circRNA的含量非常低,所以后者得到的circRNA的表达量会明显高于前者,对于后续分析,后者的结果准确性高!

Q4-外泌体

问:为什么外泌体分离之后,还要做鉴定?

答:现存的分离技术是根据外泌体的大小、结构和一些膜蛋白的捕获,很难完全将其与其他囊泡和大分子蛋白质复合体区分开,因此就需要对外泌体进行鉴定,证明你分离得到的是外泌体。

外泌体的鉴定主要依赖形态学特征(扫描电镜SEM、透射电镜TEM等电子显微镜)、颗粒粒径与浓度(纳米颗粒示踪分析NTA)、标志性蛋白(蛋白质印迹技术和流式细胞技术分析CD9、CD63、CD81、HSP90等)。

Q5-外泌体

问:样品在exosome (外泌体)提取前是否可以冻存?

答:可以。血样、尿样、体液等,需要攒齐了一起提取,或者同一个患者的样本多次提取。冻存前,首先要离心去除细胞和血小板,再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。

注:想了解更多外泌体的相关内容,欢迎查看:收藏|最全的“外泌体”研究视频,看完这些就够了

Q6-高通量测序

问:是否一定要求设置生物学重复以及重复次数?

答:目前没有生物学重复的实验发文章比较困难,尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后,遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费,无法设置生物学重复,那就得结合强有力的实验数据做支撑,比如定量实验、FISH荧光原位杂交或Northern blot等实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好,但是考虑到现实条件,重复设置≥3。一般不建议设置两个重复,因为如果两者结果不一致,我们无法确定以哪个数据为参考。

注:3个生物学重复,不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序,相当于将3个样本的基因表达量取平均值,其实就是相当于取了一个样本,由此得到的差异基因同样不可信,不能反应群体生物学现象。

Q7-生信分析

问:常用软件featureCount和Htseq-count所统计的count是什么?

答:假设一个基因Gene1包含三个外显子exon1、exon2和exon3,测序数据经比对后,若exon1上比对到三条reads,exon2上比对到4条reads,exon3上比对到1条reads,那么Gene1的counts数为1+3+4=8。

Q8-生信分析

问:DESeq2怎么对counts进行差异显著性检验?

答:DESeq2 假设counts 服从一个负二项分布(negative binomial distribution),然后利用Wald test 进行差异显著性检验。

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