博客

Science文献解读丨国自然这么多lncRNA的研究中标,你该如何出彩?

文章来自微信公众号“GCBI知识库”,版权归上海其明信息技术有限公司所有,未经许可,不得转载。转载请联系原作者。

LncRNA是这几年科研领域的当红炸子鸡,无人不知,无人不晓,在今年的国自然中也表现出色,年中标量节节攀升,中标金额也是节节攀升。

这个趋势,厉害了

不过,研究了这么久的lncRNA各种套路也是层出不穷,你可能看过各种各样的套路了,比如说这样的:

这样的:

还有这样的:

当然这种套路根据不同的层级发不同分数的文章,一旦到了10分以上,这些套路就没那么好用了,因为里面的内容都是必备的基础,算不得什么亮点。就比如说等一下小编要讲的文献里面包括上面套路里面的所有实验、所有内容,细胞水平、分子水平、动物水平、组织水平也通通都有研究。

到了20分以上,也别想什么套路了,就学学可望不可及的大神的思路好了。今天,小编要讲的17年10月26日发表在science上的这篇文章也许能给你的lncRNA研究一点思路。

本篇文章( An Interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism)由第二军医大学医学免疫学国家重点实验室、中国工程院院士曹雪涛、王品副教授研究团队发表,报道了非编码RNA(lncRNA-ACOD1)通过结合细胞内代谢酶GOT2调控胞内代谢促进病毒逃逸的新发现。

文中致谢GCBI与上海其明

研究背景

病毒感染调控一直以来是免疫学研究的热点。干扰素是机体抵抗病毒感染的关键性细胞因子,通过激活一系列干扰素诱导性基因的表达,从而激活机体的抗病毒能力。然而,干扰素以外的调控机制,尤其是病毒如何调控宿主细胞代谢的,目前知之甚少。

文章内容

接下来按照作者的思路进行讲解,作者为了解决上述问题,从基因组中表达量很高但却功能未知的非编码RNA入手,通过分析RNA测序结果筛选到lncRNA-ACOD1进行深入研究,大致分为以下四个部分:

一、为了研究lncRNAACOD1在病毒感染中的作用以及与IFN-I系统的关系,作者对有无VSV病毒处理过的野生型(WT)和IFN-1受体缺陷型(Ifnar - / - )巨噬细胞进行RNA-seq,经过分析,证实了lncRNA-ACOD1可以被独立于IFN-1的许多类型的病毒刺激(图1A),此外,在检测到的大多数细胞和器官中,lncRNA-ACOD1由病毒感染诱导(图1,B和C)。

通过Northern印迹证实lncRNA-ACOD1表达伴有有poly(A)尾(图1D)。并且,核糖体谱分析数据显示其核糖体占有率非常低(图1E),表明lncRNA-ACOD1缺乏编码潜力。

图1

二、接下来为了研究lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用,作者进行lncRNA-ACOD1敲低(图2A),显著降低了巨噬细胞中的VSV负荷(图2,B和C)。在另外两种病毒感染,DNA病毒单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和痘苗病毒(VACV)中也观察到病毒载量和先天反应的类似减少,表明lncRNA-ACOD1通过一般机制促进病毒感染。

此外,经过其他多种方法进行验证,进一步证实了lncRNA-ACOD1对病毒复制至关重要。

图2

三、为了探索lncRNA-ACOD1在体内的作用,研究者构建了lncRNA-ACOD1敲除小鼠,发现体内VSV复制在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中显着降低(图3,D和E),同时病理改变减弱(图3F)和免疫先天反应降低。

此外,当用致死剂量的VSV感染攻击时,所有lncRNA-ACOD1缺陷小鼠存活,而大多数同胞对照死亡(图3G)。

图3

由于lncRNA-ACOD1表达独立于IFN-1 / IRF3轴,为了研究lncRNA-ACOD1功能是否也与体内IFN-I / IRF3轴无关,研究者构建了双敲除小鼠(用Ifnar1 - / - 小鼠或Irf3 - / - 小鼠繁殖lncRNA-ACOD1缺陷小鼠)。

研究者发现,在没有IFN-1信号传导的情况下,lncRNA-ACOD1的缺乏导致VSV增殖的显着抑制以及减轻的免疫应答(图4,H和I)并且显着降低致命率(图4,J和K)。因此,研究者提出lncRNA-ACOD1可能通过一种新的机制而不是经典的IRF3 / IFN-1途径促进病毒复制。

图4

四、最后,研究者检查了lncRNA-ACOD1是否通过GOT2起作用。研究者先是使用修饰的ChIRP纯化内源性lncRNA-ACOD1复合物来寻找lncRNA-ACOD1相互作用分子。通过质谱分析及免疫印迹确定了GOT2(一种关键代谢酶)是lncRNA-ACOD1的结合蛋白(图5 A)。使用GOT2特异性抗体的RNA免疫沉淀(RIP)测定显示lncRNA-ACOD1(但不是其他测试的RNA)在GOT2抗体复合物中高度富集(图5 B)。

排除了对细胞活力或其他重要过程的可能作用后,研究者发现GOT2敲除显着降低了VSV复制(图5,C和D)和免疫应答,并且发现lncRNA-ACOD1过表达促进对照细胞中的病毒复制和免疫应答,而对GOT2敲低细胞没有影响(图5 E),表明GOT2的敲低阻断了lncRNA-ACOD1活性。

此外,用重组活性GOT2补充细胞挽救了lncRNA-ACOD1敲低(图5 F)和GOT2敲低(图5 G)以促进病毒复制的作用。基于这些数据,研究者提出病毒诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过直接结合代谢酶GOT2促进病毒复制。

图5

那么,lncRNA-ACOD1是如何结合并影响GOT2功能?eCLIP印迹揭示了lncRNA-ACOD1主要通过5'端(核苷酸165至390)与GOT2相互作用(图6 A)。并且发现GOT2蛋白质结构高度保守,具有大结构域,小结构域和氨基末端尾部(图6 B上部)。

接下来,研究者通过结合肽MS鉴定蛋白酶消化的lncRNA-ACOD1复合物,研究了GOT2的哪一部分与lncRNA-ACOD1相互作用。研究者发现来自GOT2小结构域中的有15个残基的肽(残基54-68)作为lncRNA-ACOD1的结合位点(图6 B,中间),其在脊椎动物中相对高度保守(图6 B,下图)。使用完整或片段缺失的GOT2,RIP测定证实这15个残基区域对于lncRNA-ACOD1结合是关键的(图6 C)。

图6

 

在结构上,结合肽在空间上接近底物位点,表明lncRNA-ACOD1可能影响GOT2的酶活性。为了验证这一假设,研究者使用纯化的GOT2蛋白和T7转录的lncRNA,在体外进行酶促反应的动力学测定。通过HPLC-MS检测L-天冬氨酸输出的速率,研究者发现lncRNA-ACOD1增强了GOT2催化活性,其依赖于其5'结合位点,如所示的kcat值(图7 D)。

此外,研究者还发现在代谢物靶向LC / MS检测中,lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中GOT2代谢物L-天冬氨酸和α-酮戊二酸显着降低(图7 E),表明体内lncRNA-ACOD1缺乏抑制GOT2酶活性。然后检查了GOT2代谢物是否可以挽救lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中抑制的病毒复制。研究者在VSV攻击前用L-天冬氨酸或α-酮戊二酸腹膜内补充lncRNA-ACOD1 - / - 小鼠,发现它们促进体内病毒复制并增加致死率(图7 F和G)。

总之,结果表明,病毒感染诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过促进GOT2催化活性及其代谢物促进病毒复制。

图7

总的来说,该文章揭示了长链非编码RNA调控细胞代谢的新机制,解释了病毒调控代谢的分子机制,为临床上研发新的抗病毒药物提供了潜在的研究靶标。同时进一步完善了病毒感染调控网络,提出了干扰素之外的病毒感染调控新通路,将非编RNA、代谢调控和病毒感染三者联系在了一起,为免疫调控机制的研究提供了新的思路。

此外,作者根据实际研究的情况进行了延伸,欢迎大家点击“阅读原文”进行详细了解。

密码:pzyg。

其中,全转录组测序、基因芯片检测及数据分析服务由上海其明(就是小编的公司啦)为曹院士、王品副教授研究团队提供。

参考:

1.An Interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism

2.第二军医大学校医学免疫学国家重点实验室在《Science》发表最新研究成果

 

(1)

本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

热评文章

发表评论