Science文献解读丨国自然这么多lncRNA的研究中标，你该如何出彩？

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LncRNA是这几年科研领域的当红炸子鸡，无人不知，无人不晓，在今年的国自然中也表现出色，年中标量节节攀升，中标金额也是节节攀升。

这个趋势，厉害了

不过，研究了这么久的lncRNA各种套路也是层出不穷，你可能看过各种各样的套路了，比如说这样的：

这样的：

还有这样的：

当然这种套路根据不同的层级发不同分数的文章，一旦到了10分以上，这些套路就没那么好用了，因为里面的内容都是必备的基础，算不得什么亮点。就比如说等一下小编要讲的文献里面包括上面套路里面的所有实验、所有内容，细胞水平、分子水平、动物水平、组织水平也通通都有研究。

到了20分以上，也别想什么套路了，就学学可望不可及的大神的思路好了。今天，小编要讲的17年10月26日发表在science上的这篇文章也许能给你的lncRNA研究一点思路。

本篇文章（ An Interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism）由第二军医大学医学免疫学国家重点实验室、中国工程院院士曹雪涛、王品副教授研究团队发表，报道了非编码RNA（lncRNA-ACOD1）通过结合细胞内代谢酶GOT2调控胞内代谢促进病毒逃逸的新发现。

文中致谢GCBI与上海其明

研究背景

病毒感染调控一直以来是免疫学研究的热点。干扰素是机体抵抗病毒感染的关键性细胞因子，通过激活一系列干扰素诱导性基因的表达，从而激活机体的抗病毒能力。然而，干扰素以外的调控机制，尤其是病毒如何调控宿主细胞代谢的，目前知之甚少。

文章内容

接下来按照作者的思路进行讲解，作者为了解决上述问题，从基因组中表达量很高但却功能未知的非编码RNA入手，通过分析RNA测序结果筛选到lncRNA－ACOD1进行深入研究，大致分为以下四个部分：

一、为了研究lncRNA－ACOD1在病毒感染中的作用以及与IFN-I系统的关系，作者对有无VSV病毒处理过的野生型（WT）和IFN-1受体缺陷型（Ifnar - / - ）巨噬细胞进行RNA-seq，经过分析，证实了lncRNA-ACOD1可以被独立于IFN-1的许多类型的病毒刺激（图1A），此外，在检测到的大多数细胞和器官中，lncRNA-ACOD1由病毒感染诱导（图1，B和C）。

通过Northern印迹证实lncRNA-ACOD1表达伴有有poly（A）尾（图1D）。并且，核糖体谱分析数据显示其核糖体占有率非常低（图1E），表明lncRNA-ACOD1缺乏编码潜力。

图1

二、接下来为了研究lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用，作者进行lncRNA－ACOD1敲低（图2A），显著降低了巨噬细胞中的VSV负荷（图2，B和C）。在另外两种病毒感染，DNA病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和痘苗病毒（VACV）中也观察到病毒载量和先天反应的类似减少，表明lncRNA-ACOD1通过一般机制促进病毒感染。

此外，经过其他多种方法进行验证，进一步证实了lncRNA-ACOD1对病毒复制至关重要。

图2

三、为了探索lncRNA-ACOD1在体内的作用，研究者构建了lncRNA-ACOD1敲除小鼠，发现体内VSV复制在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中显着降低（图3，D和E），同时病理改变减弱（图3F）和免疫先天反应降低。

此外，当用致死剂量的VSV感染攻击时，所有lncRNA-ACOD1缺陷小鼠存活，而大多数同胞对照死亡（图3G）。

图3

由于lncRNA-ACOD1表达独立于IFN-1 / IRF3轴，为了研究lncRNA-ACOD1功能是否也与体内IFN-I / IRF3轴无关，研究者构建了双敲除小鼠（用Ifnar1 - / - 小鼠或Irf3 - / - 小鼠繁殖lncRNA-ACOD1缺陷小鼠）。

研究者发现，在没有IFN-1信号传导的情况下，lncRNA-ACOD1的缺乏导致VSV增殖的显着抑制以及减轻的免疫应答（图4，H和I）并且显着降低致命率（图4，J和K）。因此，研究者提出lncRNA-ACOD1可能通过一种新的机制而不是经典的IRF3 / IFN-1途径促进病毒复制。

图4

四、最后，研究者检查了lncRNA-ACOD1是否通过GOT2起作用。研究者先是使用修饰的ChIRP纯化内源性lncRNA-ACOD1复合物来寻找lncRNA-ACOD1相互作用分子。通过质谱分析及免疫印迹确定了GOT2（一种关键代谢酶）是lncRNA-ACOD1的结合蛋白（图5 A）。使用GOT2特异性抗体的RNA免疫沉淀（RIP）测定显示lncRNA-ACOD1（但不是其他测试的RNA）在GOT2抗体复合物中高度富集（图5 B）。

排除了对细胞活力或其他重要过程的可能作用后，研究者发现GOT2敲除显着降低了VSV复制（图5，C和D）和免疫应答，并且发现lncRNA-ACOD1过表达促进对照细胞中的病毒复制和免疫应答，而对GOT2敲低细胞没有影响（图5 E），表明GOT2的敲低阻断了lncRNA-ACOD1活性。

此外，用重组活性GOT2补充细胞挽救了lncRNA-ACOD1敲低（图5 F）和GOT2敲低（图5 G）以促进病毒复制的作用。基于这些数据，研究者提出病毒诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过直接结合代谢酶GOT2促进病毒复制。

图5

那么，lncRNA-ACOD1是如何结合并影响GOT2功能？eCLIP印迹揭示了lncRNA-ACOD1主要通过5'端（核苷酸165至390）与GOT2相互作用（图6 A）。并且发现GOT2蛋白质结构高度保守，具有大结构域，小结构域和氨基末端尾部（图6 B上部）。

接下来，研究者通过结合肽MS鉴定蛋白酶消化的lncRNA-ACOD1复合物，研究了GOT2的哪一部分与lncRNA-ACOD1相互作用。研究者发现来自GOT2小结构域中的有15个残基的肽（残基54-68）作为lncRNA-ACOD1的结合位点（图6 B，中间），其在脊椎动物中相对高度保守（图6 B，下图）。使用完整或片段缺失的GOT2，RIP测定证实这15个残基区域对于lncRNA-ACOD1结合是关键的（图6 C）。

图6

 

在结构上，结合肽在空间上接近底物位点，表明lncRNA-ACOD1可能影响GOT2的酶活性。为了验证这一假设，研究者使用纯化的GOT2蛋白和T7转录的lncRNA，在体外进行酶促反应的动力学测定。通过HPLC-MS检测L-天冬氨酸输出的速率，研究者发现lncRNA-ACOD1增强了GOT2催化活性，其依赖于其5'结合位点，如所示的kcat值（图7 D）。

此外，研究者还发现在代谢物靶向LC / MS检测中，lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中GOT2代谢物L-天冬氨酸和α-酮戊二酸显着降低（图7 E），表明体内lncRNA-ACOD1缺乏抑制GOT2酶活性。然后检查了GOT2代谢物是否可以挽救lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中抑制的病毒复制。研究者在VSV攻击前用L-天冬氨酸或α-酮戊二酸腹膜内补充lncRNA-ACOD1 - / - 小鼠，发现它们促进体内病毒复制并增加致死率（图7 F和G）。

总之，结果表明，病毒感染诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过促进GOT2催化活性及其代谢物促进病毒复制。

图7

总的来说，该文章揭示了长链非编码RNA调控细胞代谢的新机制，解释了病毒调控代谢的分子机制，为临床上研发新的抗病毒药物提供了潜在的研究靶标。同时进一步完善了病毒感染调控网络，提出了干扰素之外的病毒感染调控新通路，将非编RNA、代谢调控和病毒感染三者联系在了一起，为免疫调控机制的研究提供了新的思路。

此外，作者根据实际研究的情况进行了延伸，欢迎大家点击“阅读原文”进行详细了解。

密码：pzyg。

其中，全转录组测序、基因芯片检测及数据分析服务由上海其明（就是小编的公司啦）为曹院士、王品副教授研究团队提供。

参考：

１．An Interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism

２．第二军医大学校医学免疫学国家重点实验室在《Science》发表最新研究成果