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答疑专栏丨定量qPCR-熔解曲线总是出现多峰?来看看是不是这个原因!

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GCBI的小伙伴们都超爱学习,后台收到了大家提出的各式各样的问题,实验也有,分析也有。对于这些问题,小编表示完全没在怕的,放着我来!

因为在小编的背后有着一大群专业的老师们。

为了能够帮助到更多的小伙伴,我们决定开设答疑专栏,每周挑出比较共性的问题进行详细解答,然后公布在公众号中。

本期整理了关于qPCR的问题进行解答(大家提问的时候是问题不限的哦),其中一定有你想问的,来看看吧!

1、为什么要做3个平行孔?

严谨的生物学实验,通常要求3个技术重复,而3个平行孔就是三个技术重复,是为了便于后期的生物学统计分析。

2、内标法和外标法哪种更可靠?

同样可靠。

内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致,缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制,导致它们的 PCR 效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会,但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大,也会导致它们的 PCR 效率有差异。两相比较,内标法与外标法的数据精确度是一样的。

3Ct值偏大

可能的原因是:

  1. 特殊样本:比如血清,血浆,外泌体,石蜡等。
  2. 对于基因表达丰度很低的基因,也容易呈现CT值偏大的现象
  3. cDNA稀释倍数过大,导致起始上样量浓度过低。
  4. 扩增效率低:反应条件不够优化。

设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。反应体系中有 PCR 反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

  1. PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
  2. PCR 产物太长: 一般采用 80~150 bp 的产物长度。

4数据处理时判断数据是否能用的标准?

定量PCR数据的处理要求数据满足下面两个主要的条件:扩增曲线平滑,熔解曲线单一

例如:如果熔解曲线为双峰,表示为出现非特异性扩增,则其对应的数据不可用。当满足上述条件后,还要考虑数据的重复性,这个重复性的好坏要用STDEV来衡量,STDEV<0.5,表示这三个数据的重复性可以接受;如果大于0.5,而且三个数据中又有一个数值异于其他两个值,可以剔除这个异常值,然后重新计算STDEV,如果小于0.5,则可以只将两个数值进行计算,如果大于等于0.5,则考虑重新进行实验。

5熔解曲线出现双峰甚至多峰?

可能原因是:

  1. 引物设计不够优化

--与阴性对照的熔解曲线比对可判断是引物二聚体或是非特异性扩增的影响。相应的调整引物设计,避免引物二聚体、发夹结构或非特异性扩增的出现。

  1. 引物浓度不佳

--适当降低引物的浓度(200-250 nM为宜),并注意上下游引物的浓度配比。

  1. 镁离子浓度过高

--适当降低镁离子浓度,或选择更合适的预混试剂盒。

  1. 模板有基因组的污染

--适当降低镁离子浓度,或选择更合适的预混试剂盒。

6RNA中有DNA污染,怎么处理?

  1. 若是基因组DNA的污染,可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。
  2. 若是受到外源DNA的污染,可使用抗气雾剂和UDG酶。
  3. 跨内含子设计引物,排除基因组的干扰。

7如何提高RNA的质量?

确认RNA质检的标准:RNA的质量包括两个方面:样品的纯度和完整性。RNA纯度一般用NanoDrop测量吸光值的方法进行检测,要求A260/280约在1.9~2.1之间,A260/230大于2。用凝胶电泳检测RNA的完整性,电泳图显示出清晰明亮的28S和18S条带。有Agilent 2100/4200 Bioanalyzer的实验室可以选择用测量RIN值的方法来进行检测,要求RIN值大于等于7。

提高RNA的质量就要从纯度和完整性两方面进行提高。里面有许多需要操作的细节,无法一一列出,但一般情况下,严格按照试剂盒的操作说明书进行操作,即能提取出质量较好的RNA。

有一个比较关键的注意点:提取RNA的操作环境、所有器材需保证没有RNA酶污染,且操作过程最好在冰上操作。

8无反转录酶,对照RNA仍有扩增结果?

  1. 体外转录时不可能将所有的DNA模板消除,因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。
  2. 可能是引物二聚体的条带。

9基础参数的如何优化?

  1. Mg2 + 的浓度 一般来说,对以DNA 或cDNA 为模板的PCR 反应,应选择2~5mM 浓度的Mg2 + ,对以mRNA 为模板的RT - PCR 而言,则应选择浓度为4~8mM。
  2. 模板的浓度 如果研究者是进行首次实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验,以选择出最为合适的模板浓度。基因组DNA 的模板浓度在5pg~50ng 之间选择,质粒DNA 在106 拷贝数左右选择。一般而言,使Ct 位于15~30 个循环比较合适,若大于30 则应使用较高的模板浓度,如果Ct值小于15 则应选择较低的模板深度。
  3. PCR 抑制剂 通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释,但是在某些条件下,抑制子的浓度高,而模板量少,稀释法就不再能达到好的效果,反而会使反应的敏感度降低,所以,研究者若要进行实时定量PCR 研究,最好选用纯化的模板。
  4. 引物的浓度 引物浓度太低,会致使反应不完全,若引物太多,则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR 反应,0. 5μM 是个合适的浓度,若初次选用这个浓度不理想,可在 3~1. 0μM 之间进行选择,直至达到满意的结果。
  5. 退火温度 首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm 值小5 ℃,然后在1 ℃~2 ℃内进行选择。一般退火温度要根据经验来确定,这个经验值往往同计算得到的Tm 值有较大的差距。对于定量PCR实验而言,60℃是实验非常常用的退火和延伸温度。

10如何减少 RNA 模板中的二级结构?

  1. 将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火,提高逆转录反应温度;
  2. 温度超过60°C时,不能使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的 GSP;
  3. RT-PCR 产物的长度超过 1kb时,反应温度需保持在 65°C。

以上是我们搜集到的一些小伙伴在做qPCR实验的过程中遇到的问题,同时也欢迎大家在下方或后台留言进行提问,每周我们会请专门的老师进行统一回复。

提问要求

1.类型不限,内容不限。只要是生物医学相关的问题即可。

2.问题描述清楚明白,有图直接上图(留言无法放图的话,可以发到后台),以免没有针对性。问题太宽泛的话,老师不好答,很可能会变成一个问题就能扩展成一篇文章来,但还是没能解答你的疑惑。

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