博客

国自然如此青睐的circle RNA,你知道该怎么研究吗?

下面的数据告诉你,国自然基金有多偏爱circle RNA。

2017年,国自然获批的项目中circRNA相关的项目高达176,其中2项杰出青年基金,1项优秀青年基金,2项重点项目,94项面上项目,62项青年基金项目,15项地区科学基金项目。

不过,circRNA也不是一开始就这么火的。1976年,Sanger最早发现了circRNA,但由于技术的局限性和circRNA结构的特殊性,circRNA一直被认为是错误的剪接或间接过程中的副产物,在生命活动中不具有特殊的功能。

近年来随着RNA测序技术的发展,关于circRNA的研究才越来越多。尤其是2012年,Salzman等对circRNA进行了比较全面系统报道,circRNA才开始被重新认识并深入研究,然后迅速蹿红,成为研究者心中的“明星”。

话不多说,今天小编就来跟大家唠一唠circRNA到底是个啥,以及大家是如何研究它的?↓↓

circRNA是个啥?

环状RNA( circRNA)是一类经反向剪接后、由3'末端和5'末端共价结合形成的环状非编码RNA分子,广泛存在于多种生物细胞中,具有结构稳定、序列保守及细胞或组织特异性表达等特点。

circRNA有啥特征?

1. 特殊的可变剪接所产生的,大部分由外显子产生,少部分内含子来源,广泛的存在于细胞质中,少量内含子来源的位于细胞核当中

2. 不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴,比线性RNA 稳定,不易被核酸外切酶RNase R降解。

3. 富含miRNA 结合位点,与相应microRNA 结合,起到海绵作用。

circRNA咋来的?

目前发现的circRNAs 根据来源可分为3 类:外显子来源的环状RNA,内含子来源的环状RNA和由外显子及内含子共同组成的环状RNA。

 

circRNA能干啥?

1.circRNA 最典型的一个作用机制是充当miRNA分子“海绵”,使miRNA无法与靶基因结合,进而调控靶基因的表达。

2.circRNA可以作为一种工具顺式调控疾病相关母系基因的转录,进而影响母系基因及其靶基因的表达,为相应疾病的治疗提供了一种新思路。

3.circRNA与蛋白质的相互作用。circRNA可与RNA结合蛋白结合,调节RNA结合蛋白或者RNA的胞内运输。

4.circRNA 参与蛋白翻译。最新研究发现,一直被认为是非编码RNA的circRNA也能编码多肽,并通过其行使功能。

别人怎么研究circRNA的?

1.circRNA与多种疾病密切相关,具有重要的研究价值,且稳定不易降解,所以其作为biomarker的研究是比较热门的。

2.circRNA与miRNA的相互作用关系是目前最常见的circRNA功能研究思路。

文献分析

上面说过circRNA作为miRNA分子海绵的研究最容易入手,那么大家都是怎么研究的呢?

高分文章套路好,小编就找了18年七月刚刚发表在Cell Research(IF=9.130)的一篇文章讲一讲高分文章里的清晰完整的circRNA-miRNA研究逻辑是怎么样的。

环状RNA和长非编码RNA作为调节真核生物中基因表达的有效miRNA海绵起作用。然而,功能性miRNA在胶质母细胞瘤(GBM)中的海绵仍然很大程度上未知。

研究者对GBM相关的非编码RNA进行了深入研究,发现 circNT5E能够作为miRNA-422a的海绵吸附体,抑制其活性,进而影响胶质母细胞瘤的肿瘤发生。

  1. 筛选分子

作者收集3对临床GBM样本,进行高通量检测,对其中差异表达的RNA进行生物信息学分析,挑选了548个表达上调的circRNA/lncRNA进行进一步的研究。通过TargetScan预测,确定38个高潜在的miRNA-442a海绵吸附体,并利用生物素标记的miRNA pulldown实验,锁定了目标circRNA—hsa_circ_0077232 (circNT5E)。

一般情况下,高通量检测获得数据、进行生物信息学分析筛选出与差异性的circRNA,而后选择合适的验证方法验证其作用,像作者一样做到这里就能发1-3分的文章了,要想再提高分数,就要进行功能机制的研究了。

  1. circNT5E介导的GBM表型研究

在确定目标后,就要研究一下circNT5E是不是会对GBM表型有影响,研究者使用FISH检测了正常,WHO I,WHO II,WHO III和WHO IV胶质瘤组织中的circNT5E。结果显示,随着临床分类的增加,circNT5E的表达水平显着增加(下图a-b)。

在配对的GBM肿瘤组织(n = 18)中进行的qRT-PCR测定显示肿瘤组织中circNT5E表达显着高于正常组织(下图c)。这些结果表明circNT5E在胶质瘤中起着致癌基因的作用,从而促使我们研究circNT5E的功能。而后检查细胞活力,增殖,凋亡,侵袭和迁移能力。

体内外实验表明,circNT5E不仅对GBM细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭有一定的影响,还能有效促进体内GBM肿瘤的形成。

  1. circNT5E如何行使功能

确认过表型,是遇见对的circRNA~

研究者要对circNT5EGBM中如何行使其功能进行研究。综合考虑生物素标记的miRNA pulldown实验结果,circNT5E的编码能力以及circNT5E大量稳定存在于GBM细胞质中的事实,研究者选择从ceRNA的角度来进行深入分析。

研究结果表明,circNT5E可直接结合miRNA-422a,作为其海绵吸附体影响下游靶基因的表达。

进一步实验表明,circNT5E能够通过与miRNA-422a的结合,解除miRNA-422对其下游靶基因的抑制作用,进而影响GBM细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭。

总结

  1. 研究者利用高通量的方法筛选了GBM相关的非编码RNA,circNT5E可通过海绵状胶质母细胞瘤抑制因子miRNA发挥额外的调节功能。 这些结果为开发胶质母细胞瘤的新型治疗方法提供了意见。
  2. 一个完整的分子研究的逻辑就是:确定研究疾病-筛分子-表型验证-机制研究,就像本片文章的作者那样。一般地,低分文章可只做其中的一部分研究,而高分文章为了完整论证自己的命题就要全都做,并且每一步的实验都要更严谨。
  3. 篇幅所限,在文章讲解上写的比较简短(文末点击阅读原文可以查看本篇文献),实际上本篇9分文章做了大量的表型及功能实验,而这也是比较常见的。一般来说,由于circRNA作为miRNA海绵的研究比较常见,因此要有非常严谨的研究,非常完整的论证(这通常意味着大量的实验)才能发高分。
  4. 目前,研究circRNA都离不开高通量检测。按照circRNA联合miRNA研究的经典思路:“高通量筛选-表达差异验证-细胞功能验证及动物实验-circRNA与miRNA调控关系验证-ceRNA机制验证”发非高分文章还是比较轻松的。

拓展阅读

环状RNA在疾病中的作用机制研究

零基础照样做RNA-seq差异分析

长链非编码RNA H19的文章套路和基金申请

 

 

(2)

本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

热评文章

发表评论