长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA一直是研究的热点，其作用机制多元，并不像miRNA那样具有固定的模式，这也是研究的难点之一。那如何去开展LncRNA研究呢？在转录组研究中，研究思路不外乎高通量测序，差异表达分析，选择感兴趣的基因进行功能研究。在上篇推文中，作者实验加生信分析，做到功能预测这一步，就发了4.5分SCI，那如何发高一点，再高一点的SCI呢？今天就一起来看看Science上的lncRNA研究是如何做的。
这篇文章主要探究lncRNA在树突细胞（dendritic cell，DC）分化及功能中的作用。作者发现了一个关键的lncRNA(lnc-DC)，并用实验验证了其功能和作用机制，思路图如下：
图1 文章思路图（mono指单核细胞monocytes，DC指树突细胞Dendritic cells；DC由mono分化而来的）
作者研究的是lncRNA在DC细胞分化和功能中的作用，在当时14年很少有lncRNA在免疫方面的研究。且2011诺贝尔生理学/医学奖授予的就是树突细胞研究者。树突细胞能递呈抗原，激发T细胞应答，可通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞回输给病人，诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应，所以DC在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的应用前景。
作者发现了lncRNA在细胞质中一种新的作用机制，其直接结合信号分子来调节翻译后修饰，在当时拓宽了对lncRNA作用机制的认识。
最后还需要系统严谨的实验作为支撑。作者从最初lncRNA的筛选，验证，到目标lncRNA自身特性，表达和功能机制的研究，可以说在lncRNA的研究上已经很深入，也很系统。实验一环扣一环，正反证，反正证，真正是用实验结果堆出来的文章。
下面具体看下作者是如何一步步做lncRNA的研究的。
作者首先用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化，在124个显著变化的lncRNA中（fold change>16，p<0.05），有24个被诱导。
为确保结果的准确性和可靠性，作者又用二代测序Illumina HiSeq 2000 检测了0点和第7天的lncRNA表达情况，99个lncRNA差异显著(fold>4,FDR<0.05)。对两个结果取交集，筛选了表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。
图3 二代测序lncRNA表达情况（红色为显著差异lncRNA）
2 验证lnc-DC
为确保结果的准确性，进一步用Northern blot对lncDC的表达进行了验证，确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达。在验证这一步，还可以选择qPCR，两者各有优缺点，可以自行选择合适的方法。
图4 lnc-DC的Northern blot验证结果3 Lnc-DC自身特性研究
可对目标lncRNA进行基因组定位，序列保守性，全长及结构等方面进行研究。
可用Genome browser对lnc-DC进行基因组定位，并查看其临近基因。调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。Genome browser
图5 lnc-DC和邻近基因HEATR6序列的保守性估计
图6 RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证结果
可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究，发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。
图8 lnc-DC编码能力验证结果（左，片段构建；右，免疫印迹结果）
表达特异性作者选取其他免疫细胞进行比对，分别通过实验及数据库中的数据分析，发现lnc-DC只在cDC（conventional DC）中特异性表达。
组蛋白修饰可调控基因表达，作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究，并通过DNAase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰，染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。
作者通过RNAi敲除及过表达lnc-DC来研究其功能，敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后，作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。最后表明lnc-DC促进了DC的分化，对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用，同时小鼠体内外实验也有相同结论。
图13 lnc-DC RNAi后DC抗原递呈能力（左）及激活T细胞增殖情况（右）
在机理研究中，可用排除法，先考察是否和目前已经报道的作用机制一致。LncRNA的作用机制中，其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达，在之前的实验环节，发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响。接下来作者用FISH对lnc-DC进行细胞定位，显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式，可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译，或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。RNA免疫沉淀 （RIP）表明lnc-DC不与AGO2作用，排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列，所以lnc-DC有新的作用机制。作者用pull-down（蛋白质体外结合实验）联合MS发现lnc-DC与STAT3（转录因子）相互作用，并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式，详细过程请参见文献。下图是作者推测的lnc-DC的作用机制模拟图。
图14 DC分化过程中lnc-DC的作用机制模型在mono分化至DC的过程中，组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松，促进转录因子PU.1的结合，增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质，与STAT3结合，阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化，增强了STAT3的信号通路，最终促进了DC细胞的分化。
在这简单梳理了作者的研究思路，从lncRNA的筛选，验证到功能机理研究，详细可参见文献。
这篇文章对我们有什么启发呢？
首先立意一定要新，想想有什么热点是可以与自己的研究方向结合的。其次是严谨的思路和系统的实验，这些是完全可以参照和套用的。14年lncRNA研究的science的标准在这，请大家用心体会……
本文由 GCBI学院 作者：其明技术专家 发表，转载请注明来源！
