想研究某现象的分子机制，老板豪气的来一句，先测个转录组吧，看下差异表达基因。是否在心里窃喜，制个样就完事了，太easy有木有。等大堆数据回来的时候，是不是傻眼了？从何下手挑选差异表达基因呢？今天就来聊聊测序实验中最基础的一步如何挑选差异表达基因。那差异基因是如何筛选出来的呢？差异基因的筛选方法有很多，包括倍数法、T检验、F检验及SAM等。下面简单介绍一下GCBI平台上用的倍数法和SAM法。倍数法倍数法适用于没有生物学重复的样本，其计算基因在两个条件下表达水平的比值，确定比值的阈值，将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。
SAM算法
SAM算法适用于有生物学重复的样本，通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。文献中报道，相较于其他算法，SAM算法更为稳定，筛选出的结果也更为准确。
经过适合的差异基因方法筛选出的差异基因，结果一般分为两部分，数据+图形。
数据展示如下图所示（两分组）
众多参数中，重点看三个：p-value或q-value，Fold Change。p-value或q-value这两个参数适用于有生物学重复的情况。p-value或q-value是统计学检验变量，代表差异显著性，一般p-value或q-value小于0.05代表具有显著性差异，但可根据具体情况适当调整。因为p-value或q-value衡量地是某个基因假阳性的概率，如果p-value或q-value越低，那么挑选该基因出现假阳性的概率就越低，可验证性就越高。两者具体的计算方法具体如下：
那p-value、q-value同时存在时看哪个呢？SAM法只有q-value。当两者同时存在时，可根据具体情况具体分析。差异筛选是一个典型的多重假设检验过程，对于多重假设检验，单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大，而q-value和FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言，改进了其对假阳性估计的保守性。即q-value相比于p-value更加严格，当差异基因结果较少时，可以退而求其次看p-value。Fold ChangeFold Change表示实验组比上对照组的差异表达倍数，一般表达相差2倍以上是有意义的，放宽要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。看表达倍数的同时还需结合基因表达丰度，信号值太低的基因会在后续的验证实验中检测不到。在差异结果的图形展示结果中，主要是火山图和聚类图，其可反映总体的基因表达情况。
火山图
火山图只针对两分组且有生物学重复的情况。如何看火山图呢？火山图是用Fold Change和P-value做的基因表达图，横坐标代表log2（Fold Change）,纵坐标表示-log10（P值），每个点代表一个基因，颜色用以区分基因是否差异表达，图中橙色的点代表差异表达基因，蓝色的点代表没有差异表达的基因。
聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。如上图所示的聚类图中，横坐标代表样本聚类，一列代表一个样本，聚类基于样本间基因表达的相似性，样本间基因表达越接近，靠的越近，以此类推。纵坐标代表基因聚类，一行代表一个基因，聚类基于基因在样本中表达的相似性，基因在样本中表达越接近，靠的越近，以此类推。色阶代表基因表达丰度，越红代表上调得越明显，越绿代表下调得越明显。
差异基因有了，如何挑选潜在基因进行实验验证呢？关键还在于感兴趣点在哪了，可以先看KEGG或者GO功能分类，看差异基因具体富集在哪些通路或功能。比如关注的是细胞内脂肪酸合成关键酶，可以重点看脂肪酸合成和碳流相关通路。
拓展知识：
1分钟看懂差异基因结果
一文掌握基因功能（GO）和信号通路（Pathway）分析
如何用Path-net来筛选核心通路
教你如何做趋势分析
共表达网络分析教程
本文由 GCBI学院 作者：其明技术专家 发表，转载请注明来源！
