数据分析

1分钟看懂差异基因结果

想研究某现象的分子机制,老板豪气的来一句,先测个转录组吧,看下差异表达基因。是否在心里窃喜,制个样就完事了,太easy有木有。等大堆数据回来的时候,是不是傻眼了?从何下手挑选差异表达基因呢?今天就来聊聊测序实验中最基础的一步如何挑选差异表达基因。那差异基因是如何筛选出来的呢?差异基因的筛选方法有很多,包括倍数法、T检验、F检验及SAM等。下面简单介绍一下GCBI平台上用的倍数法和SAM法。倍数法倍数法适用于没有生物学重复的样本,其计算基因在两个条件下表达水平的比值,确定比值的阈值,将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。

SAM算法

SAM算法适用于有生物学重复的样本,通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。文献中报道,相较于其他算法,SAM算法更为稳定,筛选出的结果也更为准确。

经过适合的差异基因方法筛选出的差异基因,结果一般分为两部分,数据+图形。

数据展示如下图所示(两分组)

众多参数中,重点看三个:p-value或q-value,Fold Change。p-value或q-value这两个参数适用于有生物学重复的情况。p-value或q-value是统计学检验变量,代表差异显著性,一般p-value或q-value小于0.05代表具有显著性差异,但可根据具体情况适当调整。因为p-value或q-value衡量地是某个基因假阳性的概率,如果p-value或q-value越低,那么挑选该基因出现假阳性的概率就越低,可验证性就越高。两者具体的计算方法具体如下:

那p-value、q-value同时存在时看哪个呢?SAM法只有q-value。当两者同时存在时,可根据具体情况具体分析。差异筛选是一个典型的多重假设检验过程,对于多重假设检验,单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大,而q-value和FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言,改进了其对假阳性估计的保守性。即q-value相比于p-value更加严格,当差异基因结果较少时,可以退而求其次看p-value。Fold ChangeFold Change表示实验组比上对照组的差异表达倍数,一般表达相差2倍以上是有意义的,放宽要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。看表达倍数的同时还需结合基因表达丰度,信号值太低的基因会在后续的验证实验中检测不到。在差异结果的图形展示结果中,主要是火山图和聚类图,其可反映总体的基因表达情况。

火山图

火山图只针对两分组且有生物学重复的情况。如何看火山图呢?火山图是用Fold Change和P-value做的基因表达图,横坐标代表log2(Fold Change),纵坐标表示-log10(P值),每个点代表一个基因,颜色用以区分基因是否差异表达,图中橙色的点代表差异表达基因,蓝色的点代表没有差异表达的基因。

聚类图
聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。如上图所示的聚类图中,横坐标代表样本聚类,一列代表一个样本,聚类基于样本间基因表达的相似性,样本间基因表达越接近,靠的越近,以此类推。纵坐标代表基因聚类,一行代表一个基因,聚类基于基因在样本中表达的相似性,基因在样本中表达越接近,靠的越近,以此类推。色阶代表基因表达丰度,越红代表上调得越明显,越绿代表下调得越明显。
差异基因有了,如何挑选潜在基因进行实验验证呢?关键还在于感兴趣点在哪了,可以先看KEGG或者GO功能分类,看差异基因具体富集在哪些通路或功能。比如关注的是细胞内脂肪酸合成关键酶,可以重点看脂肪酸合成和碳流相关通路。

 

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本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

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