案例解析ceRNA研究思路

在之前我们分别介绍了研究mRNA，miRNA，lncRNA的实验思路，在各自成文后，还能否进行联合分析从中挖掘和发现更多有意思的东西呢？

这就是今天要介绍的ceRNA调控分析。

ceRNA定义

ceRNA（competing endogenous RNAs）可不是新的RNA，其是竞争性內源RNA，是从功能上定义的一类RNA的总称。ceRNA具有miRNA结合位点， 能够竞争性结合miRNA， 抑制miRNA对靶基因的调控。ceRNA包括mRNA、假基因、lncRNA、circRNA等。

ceRNA研究意义

ceRNA从全新的角度解释转录体如何构建基因表达调控网络，有助于从更深层面上挖掘基因功能和调控机制。

ceRNA研究思路

如果要进行ceRNA研究，该从何切入，首先看个ceRNA研究示例。

案例

Long noncoding RNA associated-competing endogenous RNAs in gastric cancer

相关领域：胃癌            相关基因：lncRNA-FER1L4    样本：GSE47850              PMID: 25124853          IF：5.228

这篇文章主要研究lncRNA作为ceRNA在胃癌形成中的作用，思路如下图所示，作者首先筛选了可能具有ceRNA功能的差异lncRNA，再分别通过miRcode和Tarbase预测了与lncRNA相互作用的miRNA及miRNA的靶基因，构建了三者之间的网络关系，并通过数据和实验验证了其中的关系。但在最后的功能验证这块，作者未涉及。

 

图1 文章思路图

下面我们具体看下思路图中的每一步。

1. ceRNA网络构建

在ceRNA的网络中，关键在于寻找具有关系的对应的lncRNA，miRNA和mRNA。

• 差异lncRNA筛选

作者用芯片筛选得到了53个差异表达lncRNA（fold change>3,P<0.05），为保证数据的可靠性，作者只保留了在ENCODE数据库中有记录的17个lncRNA，具体情况如下图所示：

 

图2 17个差异表达lncRNA

• LncRNA-miRNA对应关系

作者所在课题组已经做过对应实验的miRNA芯片分析，找到了与胃癌形成的关键18个miRNA。作者通过miRcode来预测筛选出的17个差异lncRNA是否会和这18个miRNA存在相互作用，发现其中13个miRNA可能与9个lncRNA相互作用，具体如下：

 

图3 9个lncRNA和对应的13个miRNA

• miRNA-mRNA对应关系

找到了与lncRNA作用的miRNA，下步就是寻找与miRNA作用的靶基因。作者通过TarBase数据库预测了这13个miRNA的靶基因，结果如下图所示，其中绝大多数靶基因都和癌症相关的。

 

图4 13个miRNA对应的靶基因

• 网络构建

找到lncRNA，miRNA及mRNA对应的关系之后，就可以构建ceRNA网络了，结果如下图所示，为进一步挖掘结果，作者通过Re-sampling analysis用P值来衡量每个关系。

 

图5 ceRNA网络（彩色的点代表miRNA，黑色的点代表lncRNA，灰色的点代表mRNA）

2.关系验证

• 其他数据佐证

为进一步佐证构建的ceRNA网络，作者用其他6种癌症的数据进行回归分析，结果表明网络图中的lncRNA与mRNA有很好的相关性。

 

图6 其他肿瘤中lncRNA与mRNA表达关系

• 实验验证

在实验验证中，作者挑选了FER1L4-miR-106a-5p-RB1这对关系作为研究对象， 因FER1L4首次预测到与癌形成中重要的miR-106a-5p可能存在相互作用关系。在关系验证中，需分别验证lncRNA-miRNA和 lncRNA- mRNA之间的关系。

lncRNA和miRNA关系

双荧光素酶报告实验结果表明变异的FER1L4质粒比野生型的荧光素酶活性高56%，说明FER1L4替换的序列影响了FER1L4和miR-106a-5p的结合，从而证实了FER1L4和miR-106a-5p的相互作用。

 

图7 FER1L4正常和变异序列

lncRNA- mRNA

ceRNA网络调控最后的成效是lncRNA通过与miRNA作用最后影响了mRNA的表达丰度。作者用siRNA和qpcr表明敲除FER1L4导致了RB1表达丰度的降低。

作者通过系列实验和分析表明lncRNA可以在胃癌形成中作为ceRNA起作用，并验证了ceRNA网络关系中FER1L4-miR-106a-5p-RB1的作用关系。

总结

更普适的ceRNA研究思路如下所示，当获得差异表达当获得差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA数据时，先构建ceRNA网络，其次验证他们之间的关系，更深入的可以进行功能研究。

 

图8 ceRNA研究思路

不建议单纯从ceRNA的假说角度出发去研究非编码RNA的生物学功能，因为作为ceRNA的比例还是少的。如果真要做，如何提高把握呢？一是可以通过数据库中现有的ceRNA相互作用关系来寻找研究对象，如ceRBD,InCeDB,Linc2GO,miRcode等；另一种则是通过实验AGO HITS-CLIP(高通量测序-交联免疫沉淀)直接将于miRNA相互作用的那部分ceRNA提取出来测序进行研究。

从差异分析到ceRNA研究，这段时间把生信分析中的各个环节简单梳理了一遍（往期回顾见拓展知识），下面我们将开启测序篇，敬请期待！

 

文中涉及工具及数据库：

ENCODE（Encyclopedia of DNA Elments）：旨在描述人类基因组中所编码的全部功能性序列元件。

miRcode：预测lnc RNA中假定的miRNA靶点。

TarBase: 一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。

 

拓展知识：

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