临床研究

案例解析ceRNA研究思路

在之前我们分别介绍了研究mRNA,miRNA,lncRNA的实验思路,在各自成文后,还能否进行联合分析从中挖掘和发现更多有意思的东西呢?

这就是今天要介绍的ceRNA调控分析。

ceRNA定义

ceRNA(competing endogenous RNAs)可不是新的RNA,其是竞争性內源RNA,是从功能上定义的一类RNA的总称。ceRNA具有miRNA结合位点, 能够竞争性结合miRNA, 抑制miRNA对靶基因的调控。ceRNA包括mRNA、假基因、lncRNA、circRNA等。

ceRNA研究意义

ceRNA从全新的角度解释转录体如何构建基因表达调控网络,有助于从更深层面上挖掘基因功能和调控机制。

ceRNA研究思路

如果要进行ceRNA研究,该从何切入,首先看个ceRNA研究示例。

案例

Long noncoding RNA associated-competing endogenous RNAs in gastric cancer

相关领域:胃癌            相关基因:lncRNA-FER1L4    样本:GSE47850              PMID: 25124853          IF:5.228

这篇文章主要研究lncRNA作为ceRNA在胃癌形成中的作用,思路如下图所示,作者首先筛选了可能具有ceRNA功能的差异lncRNA,再分别通过miRcodeTarbase预测了与lncRNA相互作用的miRNA及miRNA的靶基因,构建了三者之间的网络关系,并通过数据和实验验证了其中的关系。但在最后的功能验证这块,作者未涉及。

 

图1 文章思路图

下面我们具体看下思路图中的每一步。

1. ceRNA网络构建

在ceRNA的网络中,关键在于寻找具有关系的对应的lncRNA,miRNA和mRNA。

  • 差异lncRNA筛选

作者用芯片筛选得到了53个差异表达lncRNA(fold change>3,P<0.05),为保证数据的可靠性,作者只保留了在ENCODE数据库中有记录的17个lncRNA,具体情况如下图所示:

 

图2 17个差异表达lncRNA

  • LncRNA-miRNA对应关系

作者所在课题组已经做过对应实验的miRNA芯片分析,找到了与胃癌形成的关键18个miRNA。作者通过miRcode来预测筛选出的17个差异lncRNA是否会和这18个miRNA存在相互作用,发现其中13个miRNA可能与9个lncRNA相互作用,具体如下:

 

图3 9个lncRNA和对应的13个miRNA

  • miRNA-mRNA对应关系

找到了与lncRNA作用的miRNA,下步就是寻找与miRNA作用的靶基因。作者通过TarBase数据库预测了这13个miRNA的靶基因,结果如下图所示,其中绝大多数靶基因都和癌症相关的。

 

图4 13个miRNA对应的靶基因

  • 网络构建

找到lncRNA,miRNA及mRNA对应的关系之后,就可以构建ceRNA网络了,结果如下图所示,为进一步挖掘结果,作者通过Re-sampling analysis用P值来衡量每个关系。

 

图5 ceRNA网络(彩色的点代表miRNA,黑色的点代表lncRNA,灰色的点代表mRNA)

2.关系验证

  • 其他数据佐证

为进一步佐证构建的ceRNA网络,作者用其他6种癌症的数据进行回归分析,结果表明网络图中的lncRNA与mRNA有很好的相关性。

 

图6 其他肿瘤中lncRNA与mRNA表达关系

  • 实验验证

在实验验证中,作者挑选了FER1L4-miR-106a-5p-RB1这对关系作为研究对象, 因FER1L4首次预测到与癌形成中重要的miR-106a-5p可能存在相互作用关系。在关系验证中,需分别验证lncRNA-miRNA和 lncRNA- mRNA之间的关系。

lncRNA和miRNA关系

双荧光素酶报告实验结果表明变异的FER1L4质粒比野生型的荧光素酶活性高56%,说明FER1L4替换的序列影响了FER1L4和miR-106a-5p的结合,从而证实了FER1L4和miR-106a-5p的相互作用。

 

图7 FER1L4正常和变异序列

lncRNA- mRNA

ceRNA网络调控最后的成效是lncRNA通过与miRNA作用最后影响了mRNA的表达丰度。作者用siRNA和qpcr表明敲除FER1L4导致了RB1表达丰度的降低。

作者通过系列实验和分析表明lncRNA可以在胃癌形成中作为ceRNA起作用,并验证了ceRNA网络关系中FER1L4-miR-106a-5p-RB1的作用关系。

总结

更普适的ceRNA研究思路如下所示,当获得差异表达当获得差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA数据时,先构建ceRNA网络,其次验证他们之间的关系,更深入的可以进行功能研究。

 

图8 ceRNA研究思路

不建议单纯从ceRNA的假说角度出发去研究非编码RNA的生物学功能,因为作为ceRNA的比例还是少的。如果真要做,如何提高把握呢?一是可以通过数据库中现有的ceRNA相互作用关系来寻找研究对象,如ceRBD,InCeDB,Linc2GO,miRcode等;另一种则是通过实验AGO HITS-CLIP(高通量测序-交联免疫沉淀)直接将于miRNA相互作用的那部分ceRNA提取出来测序进行研究。

从差异分析到ceRNA研究,这段时间把生信分析中的各个环节简单梳理了一遍(往期回顾见拓展知识),下面我们将开启测序篇,敬请期待!

 

文中涉及工具及数据库:

ENCODE(Encyclopedia of DNA Elments):旨在描述人类基因组中所编码的全部功能性序列元件。

miRcode:预测lnc RNA中假定的miRNA靶点。

TarBase: 一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。

 

拓展知识:

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本文由 GCBI学院 作者:乞嘚咙咚呛咚呛 发表,转载请注明来源!

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